- 相關(guān)推薦
中醫(yī)專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告
中醫(yī)專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告(一)
一、立題依據(jù)(科學(xué)意義及國內(nèi)外現(xiàn)狀分析及參考文獻(xiàn))
惡性黑色素瘤是一種高度惡性且最具侵襲性的癌之一，多發(fā)生于皮膚，早期發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。對放、化療不敏感，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率增高，人們一直在期待著可以征服惡性黑素瘤的新的療法的出現(xiàn)!
最近大量的數(shù)據(jù)表明惡性腫瘤的發(fā)展與T-鈣粘蛋白的表達(dá)變化相關(guān).T-鈣粘蛋白已在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌[1-3] 、胃癌、胰腺癌、卵巢癌[4-9]等多種惡性腫瘤中被檢測到表達(dá)減少.最近的研究表明T/H—鈣粘蛋白在乳腺癌中的重新表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的生長,降低體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的侵襲潛能[1].T/H—鈣粘蛋白這個(gè)新型鈣粘蛋白分子在人類許多癌細(xì)胞中表達(dá)都降低表明它或許在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]及維持正常細(xì)胞的表型中起重要作用。
T/H—鈣粘蛋白與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系,也許它會(huì)為腫瘤的診斷和治療帶來新的契機(jī).
T-鈣粘蛋白是否對惡性黑色素瘤也有作用，目前還沒有相關(guān)研究的報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行相關(guān)方面的探討性研究!
二、研究內(nèi)容及預(yù)期成果(說明具體研究內(nèi)容、創(chuàng)新點(diǎn)及擬解決的關(guān)鍵問題、預(yù)期成果及提供形式)
研究內(nèi)容：
第一部分：正常表皮組織、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中T-cadherin表達(dá)情況
第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建
第三部分：T-cadherin基因的真核表達(dá)及生物活性分析
創(chuàng)新點(diǎn)：首次將T-cadherin基因轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞
擬解決的關(guān)鍵問題：通過RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出T-cadherin的基因全長。
預(yù)期成果及提供形式：
觀察T-鈣粘蛋白在正常皮膚組織細(xì)胞、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況!
進(jìn)一步闡明T-鈣粘蛋白作用機(jī)制
T-鈣粘蛋白基因轉(zhuǎn)染入黑色素瘤細(xì)胞后觀察對其增殖和轉(zhuǎn)移活性的抑制情況，探索臨床診斷和治療黑色素瘤及其它腫瘤的方法!
中醫(yī)專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告(二)
一 研究目的與意義
1.研究目的
百合病最早見于張仲景的《金匱要略》，屬中醫(yī)情志病范疇�！督饏T﹒百合狐惑陰屬陽毒病證治》篇將“百合病”描述為：“意欲食復(fù)不能食，常默然，欲臥不能臥，欲行不行，飲食或有美時(shí)，或有不用聞食臭時(shí)，如寒無寒，如熱無熱，口苦，小便赤，諸藥不能治，得藥則劇吐利，如有神靈者，身形如和，其脈微數(shù)。”從百合病的臨床表現(xiàn)看，與抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)有較多的相似之處。所以現(xiàn)代不少醫(yī)家都將中醫(yī)的百合病歸屬于抑郁癥[1,2,3]。百合知母湯為治療百合病的經(jīng)典方藥之一，由百合和知母兩味藥組成。百合寧心安神，潤肺止咳;知母清熱瀉火，滋陰潤燥。百合甘寒清潤而不膩，知母苦寒降火而不燥。百合偏于補(bǔ)，知母偏于瀉。二藥伍用，一潤一清，一補(bǔ)一瀉，共奏潤肺清熱，寧心安神之效。主治陰虛或溫?zé)岵『笥酂崮┣澹灾骂^昏、心煩不安、失眠等癥以及情志不遂，以致精神恍惚、不能自制等癥。故本課題旨在通過體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示百合知母湯抗抑郁可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
2.研究意義
抑郁癥是常見的危害人類身心健康一類精神疾病，以顯著而持久的情感或心境低落為主要特征，在WHO的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)査中發(fā)現(xiàn)全世界約有10%-20%的人一生中曾有過抑郁體驗(yàn)[4]。隨著現(xiàn)代社會(huì)的生活壓力逐漸增高、工作節(jié)奏加快，人們處于應(yīng)激狀態(tài)中的機(jī)會(huì)增多，抑郁癥的發(fā)病率更逐年上升[5,6]，越來越多的患者正遭受抑郁癥的折磨，給家庭及社會(huì)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，加強(qiáng)抑郁癥的防治，尋找安全、有效的治療方法，具有非常重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，誘因繁多，針對某一單一環(huán)節(jié)的藥物難以取得滿意的療效，許多抗抑郁西藥存在抗抑郁譜窄、起效慢、藥價(jià)高、依從性差、副作用大及易復(fù)發(fā)等不足[7]。傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)中蘊(yùn)含著豐富的心身醫(yī)學(xué)思想，其“形神合一論”，“天人合一論”就包含了廣義的心身醫(yī)學(xué)思想。因此國內(nèi)外越來越重視傳統(tǒng)中草藥及復(fù)方抗抑郁的研究，開展了廣泛而深入的實(shí)驗(yàn)研究，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)研究成果在臨床運(yùn)用中也取得了良好的療效，為中醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代心身醫(yī)學(xué)的融合、發(fā)展提供了新的契機(jī)。中醫(yī)心身醫(yī)學(xué)研究工作逐漸起步，心身醫(yī)學(xué)的中醫(yī)藥防治研究工作在病因病機(jī)及臨床診斷方面也取得一定的進(jìn)展[8]。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，抗抑郁藥物抗抑郁作用機(jī)制已由細(xì)胞外單胺遞質(zhì)途徑，逐步轉(zhuǎn)向細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，而目前針對百合知母湯抗抑郁作用機(jī)制的研究大都局限在行為學(xué)觀測、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)內(nèi)分泌等方面。本研究采用大鼠慢性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)抑郁模型，對百合知母湯的抗抑郁作用及其細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為其進(jìn)一步的新藥開發(fā)研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
二 研究現(xiàn)狀
1.百合病的研究現(xiàn)狀
1.1百合病的起源
百合病始見于張仲景《金匱要略·百合狐惑陰陽毒病證治第三》篇：百合病者，百脈一宗，悉致其病也。意欲食復(fù)不能食，常默然，欲臥不能臥，欲行不能行，飲食或有美時(shí)，或有不用聞食臭時(shí)，如寒無寒，如熱無熱，口苦，小便赤，諸藥不能治，得藥則劇吐利，如有神靈者，身形如和，其脈微數(shù)。這段文字概括了百合病的主要癥狀是精神、飲食、睡眠、行為、語言、感覺的失調(diào)，與西醫(yī)學(xué)抑郁癥的主要癥狀有頗多相似之處。“百脈一宗者，分之則為百脈，合之則為一宗”因人體百脈同出一源，源病則百脈合病，周身受累，因此而得名百合病。
1.2百合病的病因病機(jī)
百合病的病因病機(jī)為傷寒熱病之后，余熱傷陰，或情志不遂，郁熱傷陰，導(dǎo)致心肺陰虛內(nèi)熱，百脈失養(yǎng)而成。病機(jī)特點(diǎn)是心肺陰虛內(nèi)熱，心神失養(yǎng)，以神志改變?yōu)橹饕R床特點(diǎn)。心肺陰虛，余邪未盡，則出現(xiàn)口苦、小便赤、脈微數(shù)。該組癥狀是百合病的主要客觀體征。百脈遍布周身，百脈失和，則行動(dòng)感覺變異，如“欲臥不能臥，欲行不能行”“意欲食復(fù)不能食，飲食或有美時(shí)，或有不用聞食嗅時(shí)”“如寒無寒，如熱無熱”等。神志失和，則現(xiàn)“如有神靈者”“常默默”。
1.3百合病的治療法則
百合病以心肺陰虛為基本病機(jī)，以滋養(yǎng)心肺、潤燥安神為治療法則�？�“隨證治之”分為以下幾型：①正治法：“百合病，不經(jīng)吐、下、發(fā)汗，病形如初者，百合地黃湯主之。”百合病未經(jīng)誤治，日雖久而病形如初者，以滋養(yǎng)心肺陰血，清熱安神為法，以百合地黃湯主之。取百合潤養(yǎng)心肺，清氣分虛熱，生地滋養(yǎng)心血，清血分虛熱，泉水煎藥，取清熱助陰，血熱從小便下行之功。諸藥合用，心肺得養(yǎng)，氣血同治，陰復(fù)熱清，百脈和調(diào)，病癥自除。②誤汗后：“百合病發(fā)汗后者，百合知母湯主之。” 百合病誤用汗法，汗后陰液受傷，心肺陰虛加重，燥熱尤甚，除具備百合病的基本癥狀外，尚可出現(xiàn)津傷燥熱的心煩、少寐、口干或渴、午后潮熱、小便短少等癥候。治宜養(yǎng)陰清熱、潤澡除煩，用百合知母湯主治。③誤下后的滑石代赭湯(百合、滑石、代赭石)。④誤吐后的百合雞子湯(百合、雞子黃)。⑤久病變渴的外用百合洗方(百合)。如內(nèi)服外洗仍口渴不解，方用栝蔞牡蠣散(栝蔞根、牡蠣)。⑥久病變發(fā)熱的百合滑石散(百合、滑石)。
2.抑郁癥的研究現(xiàn)狀
2.1抑郁癥的起源
抑郁癥是一種情感性精神障礙，臨床上以情緒低落、思維遲緩和精神運(yùn)動(dòng)性抑制為特征，其它癥狀包括喪失自尊、不恰當(dāng)?shù)膬?nèi)疚感、死亡和自殺念頭、注意力集中程度降低以及睡眠和食欲減退，還可能伴有各種軀體癥狀。
抑郁癥是一種最普通的精神疾病。我國對情感性精神障礙進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查1985年：終生患病率約為12%。我國對抑郁癥的識(shí)別率低,臨床漏診率達(dá)50-60%。一般內(nèi)科醫(yī)生對包括抑郁癥在內(nèi)的心理障礙的識(shí)別率只有15.9%,約只有1/4的抑郁癥病人才能接受正規(guī)治療。有專家認(rèn)為我國抑郁癥的發(fā)病率應(yīng)為10-15%，隨著人口的逐步老齡化，抑郁癥在60歲以上人群中的發(fā)病率將高達(dá) 20%～50%。1994年WHO全球調(diào)查發(fā)現(xiàn),抑郁癥的現(xiàn)癥患病率現(xiàn)癥患病率為11.4%,終生患病率為20-30%。約13 - 20%的人一生中曾有過至少一次抑郁體驗(yàn)�！�2001 年世界衛(wèi)生報(bào)告》指出，抑郁癥目前已成為世界第四大疾患，到 2020 年抑郁癥可能成為僅次于心臟病的第二大疾病，抑郁癥正在成為一個(gè)嚴(yán)重的全球問題[9-13]。
2.2抑郁癥的發(fā)病
抑郁癥的病因十分復(fù)雜，一般認(rèn)為病因可能與遺傳、人格特征、心因因素有關(guān)。其發(fā)病機(jī)制也處于假說階段，主要包括單胺遞質(zhì)學(xué)說、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)說、信號(hào)通路學(xué)說[14-15]。
單胺假說作為抑郁癥研究的重點(diǎn)認(rèn)為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(如5-輕色胺、多巴胺、去甲腎上腺素等)的失衡可導(dǎo)致抑郁的發(fā)生。大量研究亦顯示抑郁癥與遺傳、神經(jīng)、心理等因素誘發(fā)的中樞5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine, DA)等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量降低及其受體功能下降有關(guān)[16-17]。有研究[18]表明抑郁模型大鼠下丘腦、紋狀體、海馬內(nèi)5-HT、NE及DA及其代謝產(chǎn)物、合成前體的含量明顯降低。這也支持了經(jīng)典的單胺遞質(zhì)學(xué)說。①5-HT：抑郁癥的發(fā)病機(jī)制涉及突觸間隙5-HT水平及5-HT受體亞型功能的失調(diào)。5-HT功能活動(dòng)降低,則患者心情抑郁、食欲減退、運(yùn)動(dòng)活動(dòng)減少。Coppent[19]等于1965年首先提出5-HT與抑郁癥有關(guān),認(rèn)為抑郁癥是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT釋放減少,突觸間隙的含量下降而引起的。近年來,研究發(fā)現(xiàn)了很多5-經(jīng)色胺的受體亞型,使得5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)與抑都癥發(fā)病的關(guān)系越來越受到關(guān)注。②NE：大量研究證明腦內(nèi)N E的絕對或相對缺乏會(huì)引起情緒低落、心境抑郁。Schildkraut[20]于1965年首先提出抑郁癥的發(fā)生是由于腦中NE不足所致,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NE含量不足則發(fā)生抑郁癥NE的缺乏可能是由于內(nèi)源性的生成釋放異�；蛴捎贜E系統(tǒng)慢性刺激所致的繼發(fā)性粍竭[21]。Bmnello[22]等指出,自從發(fā)現(xiàn)一些藥物通過改變NE代謝既能導(dǎo)致抑郁癥又能緩解抑郁癥,NE在抑郁癥中所起的作用越來越受到關(guān)注。③DA：1975年Randrup首先提出,抑郁癥的發(fā)病可能與DA有關(guān)。后來Maj等研究者證實(shí),幾乎所有長期抗抑郁治療的患者都會(huì)增加D A誘導(dǎo)的獎(jiǎng)賞反應(yīng)。1983年Willner等提出抑郁癥存在DA功能的降低,尤其是伴隨有精神運(yùn)動(dòng)遲滯的患者[23]。對抑郁癥自殺者尸檢結(jié)果提示,抑郁癥自殺患者尾狀核和伏核的DA代謝率降低[24]。
目前,抑郁癥的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制研究中,下丘腦一垂體一腎上腺軸(HPA軸)功能亢進(jìn)是較為公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制之一。大量研究顯示,抑郁癥患者的HPA軸功能亢進(jìn),血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素CHR、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇(CORT)濃度明顯升高,而且這種功能亢進(jìn)是依賴性的,隨著抑郁的恢復(fù),HPA軸的功能也逐步恢復(fù)正常[25]。Catalan[26]等發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者下丘腦及下丘腦外的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)濃度都升高,重度抑郁組比輕度與中度抑郁發(fā)作CRF血濃度更高,且CRF與皮質(zhì)醇血濃度顯著相關(guān)。
在發(fā)病機(jī)制方面，受體后信號(hào)通路及其第二信使系統(tǒng)在該病發(fā)病及治療中的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。以腦內(nèi)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein ,CREB )為交匯點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路正受到越來越多的關(guān)注，尤其是海馬CREB的改變。早在1996 年，Nibuya[27]等就報(bào)道抗抑郁治療，大鼠海馬 CA1 區(qū)、CA3 區(qū)和齒狀回均可見CREB mRNA的表達(dá)增多。CREB 可能是各種抗抑郁信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)。海馬CREB的表達(dá)和活化受到多種信號(hào)分子和信號(hào)通路的影響：
�、傧佘账岘h(huán)化酶/環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A通路(AC/cAMP/PKA通路)，是研究最早的抗抑郁通路。其主要過程是：胞外信號(hào)激活胞膜上G蛋白耦聯(lián)受體→AC激活→胞內(nèi)cAMP升高(降解cAMP的酶主要是磷酸二酯酶)→PKA激活→CREB磷酸化→調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄→生物學(xué)效應(yīng)。Li和Branski[28,29]等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)海馬cAMP通路的激活對改善抑郁癥狀起積極作用。
�、诶野彼峒っ甘荏wB/絲裂原活化蛋白激酶/核糖體 S6激酶通路(TrKB/MAPK/RSK通路)，是一條和細(xì)胞生長、增殖、凋亡以及突觸可塑性密切相關(guān)的信號(hào)通路。在各種 MAPK 通路中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)信號(hào)通路與抑郁癥關(guān)系最為密切。ERK1/2 通路激活的大致過程是：TrKB 的激活→MAPK激酶激酶(MAPKKK, RAF)的激活→MAPK激酶(MAPKK, MEK)的激活→ERK1/2的激活→RSK的激活→ CREB 磷酸化→調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄→生物學(xué)效應(yīng)。抑郁癥患者的尸檢報(bào)告顯示腦內(nèi)MAPK減少可能是嚴(yán)重抑郁癥的病因之一[30]。
③Ca2+/鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶通路(Ca2+/CaM/CaMK通路)，通路涉及多種離子通道、受體和酶，其激活的主要過程是：胞漿內(nèi)鈣濃度升高→鈣離子與CaM結(jié)合→激活CaMK→CREB磷酸化→調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄→生物效應(yīng)。王慶松等[31]利用貓對大鼠造成急性捕食應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)在捕食應(yīng)激后大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)CaM 信號(hào)通路調(diào)控紊亂，表現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度明顯升高，Ca2+-CaM 復(fù)合體增多，CaMK的表達(dá)升高，提示海馬該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在嚴(yán)重心理應(yīng)激所致的行為異常中可能有重要意義。
3.百合知母湯的研究現(xiàn)狀
3.1百合的研究現(xiàn)狀
方中百合為百合科植物百合Lilium brownii F. E. Brown var. colchesteri Wils.、卷丹 Lilium lancifolium Thunb.和細(xì)葉百合 Lilium pumilum DC.的肉質(zhì)鱗莖。味甘，性微寒。入心、肺經(jīng)。本品氣味稍緩，甘中有收，既能清心肺之余熱，而斂氣養(yǎng)心、安神定魄，用于治療熱性病后、余熱末盡所引起的神思恍惚、煩躁失眠、莫名所苦的“百合病”，又能潤肺止咳，用于治療肺燥咳嗽，或肺虛久咳，或陰虛久咳、痰中帶血等癥。
百合中主要含有酚酸甘油酯、苷類、生物堿及多糖，另外還含有一些磷脂、蛋白質(zhì)和無機(jī)元素。藥理研究表明百合具有抗癌、止咳、耐缺氧與抗疲勞、提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能等作用[32-34]。
3.2知母的研究現(xiàn)狀
方中知母為百合科植物知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的根莖。味苦、甘，性寒。入肺、胃、腎經(jīng)。本品質(zhì)潤，苦寒不燥、，沉中有浮，降中有升。上行能清肅肺氣，以瀉肺火，潤肺燥、除煩熱、止咳嗽，用于治療溫?zé)岵�，邪在氣分，癥見高熱、煩躁、口渴、脈洪大者，以及陰虛燥咳，或肺熱咳嗽諸癥;入于中，善清胃火、除煩渴，用于治療消渴病之中消諸癥;行于下，則能瀉相火、滋腎燥，用于治療陰虛火旺、骨蒸潮熱、盜汗等癥。
知母主要含有皂苷、黃酮、雙苯吡酮、木脂素等成分�，F(xiàn)代研究表明，知母具有抗病原微生物、抗血小板聚集、降血糖、解熱、抗炎、降低轉(zhuǎn)氨酶等多種藥理活性[35-37]。
3.3 百合知母湯的研究現(xiàn)狀
百合知母湯有養(yǎng)陰清熱、除煩潤燥之效，以潤養(yǎng)心肺為大法，治療百合病誤汗后，津液受傷，虛熱較甚者。臨床上運(yùn)用百合知母湯治療乳腺增生病[38-39]、長期低熱[40]、消渴、喘證、盜汗、胃脘痛[41]、失眠[42]、抑郁[43]等癥。
三 研究思路與立題依據(jù)
1.研究思路
百合知母湯是《金匱要略》中治療百合病的經(jīng)典方劑。百合病的描述“百合病者，百脈一宗，悉致其病也，欲臥不能臥，欲行不能行……意欲食復(fù)不能食，常默默，如有神靈者……”主要?dú)w納為情緒障礙、軀體不適，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)有很大的相似性，因此一般將百合病歸屬于抑郁癥范疇。百合知母湯中的部分有效成分能通過提高抑郁癥大鼠大腦皮層單胺遞質(zhì)、抑制HPA軸亢進(jìn)、提高模型動(dòng)物腦組織BDNF含量等途徑發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。
CREB 可能是各種抗抑郁信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)�？挂钟羲幬�(包括中藥)或其它治療措施可通過調(diào)節(jié)一種或幾種通路，最終激活CREB，調(diào)節(jié) BDNF 等基因表達(dá)，影響神經(jīng)元增殖、分化、成熟等可塑性改變，發(fā)揮抗抑郁作用。參與調(diào)節(jié)CREB的各調(diào)節(jié)因子之間、通路之間存在復(fù)雜的交叉聯(lián)系和相互作用，共同維持著CREB活性的平衡。近年來研究提示：抑郁模型小鼠，存在神經(jīng)元蛋白和營養(yǎng)因子在海馬的表達(dá)異常，而這些變化可以被一些中藥逆轉(zhuǎn)[44]。當(dāng)前致力于闡明信號(hào)通路、CREB、營養(yǎng)因子、神經(jīng)再生之間是如何相互聯(lián)系的，以及細(xì)胞靶點(diǎn)、分子應(yīng)答、行為反應(yīng)的調(diào)節(jié)與抗抑郁之間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系。這將有助于我們以CREB為中心了解抑郁癥的病理生理機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)出療效可靠、起效迅速、副作用小、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的新藥，尤其是幫助我們更好地認(rèn)識(shí)一些中藥抗抑郁的可能機(jī)制，更充分地利用祖國寶貴的中醫(yī)藥資源。
細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前抗抑郁機(jī)制研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)�？杀欢喾N不同的信號(hào)路徑激活。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)等3條通路是目前認(rèn)為與抗抑郁相關(guān)、最主要的信號(hào)通路，這3個(gè)主要上游通路最終都使CREB磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游通路的基因表達(dá)，完成神經(jīng)元生化功能，而CREB是上述3種通路的交匯點(diǎn)。
前期的研究證實(shí)：百合知母湯抗抑郁的機(jī)制與提高慢性不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)抑郁(CUMS)模型大鼠海馬組織5-HT含量、提高腦組織中CREB(cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)mRNA的表達(dá)有關(guān)(見7.3)。有鑒于此，我們提出假設(shè)：百合知母湯抗抑郁的信號(hào)機(jī)制可能與以上三種細(xì)胞內(nèi)通路有關(guān)，三個(gè)通路在抗抑郁機(jī)制中可能會(huì)有所偏重。
圍繞假設(shè)，基于CREB磷酸化通路，本課題擬將百合知母湯作用于CUMS大鼠，運(yùn)用ELISA、RT-PCR、免疫組化、Western 印記等方法，檢測大腦組織cAMP信號(hào)中cAMP和PKA、MAPK信號(hào)中TrKB和BDNF、CaMK信號(hào)中鈣調(diào)蛋白(CaM)和CaMK等關(guān)鍵因子，初步探討百合知母湯抗抑郁的信號(hào)機(jī)制,篩選出該方抗抑郁的基因靶點(diǎn)。
2.立題依據(jù)
中藥復(fù)方具有成分多、作用環(huán)節(jié)多、靶點(diǎn)多的特點(diǎn)，多環(huán)節(jié)之間具有協(xié)同效應(yīng)。因此研究中藥及其方劑的抗抑郁作用具有極大的挖掘潛力，而且對解決日益增加的抑郁患者的痛苦有重大的社會(huì)意義[45-46]。
四 研究內(nèi)容及目標(biāo)
1.建立慢性不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)大鼠抑郁(CUMS)模型;
2.通過檢測用藥前后模型動(dòng)物大鼠海馬組織環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)含量變化，評價(jià)百合知母湯對抑郁癥cAMP信號(hào)的干預(yù)作用;
3.通過檢測用藥前后模型動(dòng)物大鼠絡(luò)氨酸激酶受體B(TrKB)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)含量變化，評價(jià)百合知母湯對抑郁癥MAPK信號(hào)的干預(yù)作用;
4.通過檢測用藥前后模型動(dòng)物大鼠海馬組織中鈣調(diào)蛋白(CaM)和鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)含量變化，評價(jià)百合知母湯對抑郁癥CaMK信號(hào)的干預(yù)作用;
五 擬解決的關(guān)鍵問題
通過檢測cAMP、MAPK、CaMK三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑上重要調(diào)節(jié)因子cAMP、PKA、TrKB、BDNF、CaM、CaMK用藥前后的變化，初步評估百合知母湯對以上三個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的干預(yù)作用，評價(jià)方劑抗抑郁的機(jī)制，以便進(jìn)一步篩選出方劑抗抑郁靶點(diǎn)。
六 實(shí)驗(yàn)研究方案
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SD雄性大鼠，7—12周齡，體重180—200g
2.藥物制備
按照《金匱要略》中記載的方法：百合七枚(劈)(約20g)，知母三兩(切)(約10g)即百合：知母=2:1。取百合100g，知母50g，先以清水將百合浸泡12小時(shí)，當(dāng)白沫出，去其水，再加清水2000ml，武火煎開后改為文火，得百合煎煮液1000ml;再用清水2000ml，先武火后文火，得知母煎煮液1000ml;將2次煎煮液混合，文火濃縮得煎煮液1500ml。按照比例配制足夠數(shù)量百合知母湯煎煮液，放入冰箱-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆�。臨用時(shí)取出，濃縮至合適體積。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性，所有實(shí)驗(yàn)都用同一批藥材。所有藥物的給藥劑量根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算而來：大鼠(200g)用藥量=人(70kg)日用劑量*0.018。每只大鼠的給藥體積為1ml/100g。
百合知母湯終濃度為2.2g/Kg/d(成人日用量30g)
氟西汀終濃度為1.8mg/kg/d(成人日用量20mg)
各組按濃度給藥28天，對照組給等體積的三蒸水。
3.CUMS抑郁癥模型大鼠制備
除正常對照組外，其余動(dòng)物采用慢性輕度不可預(yù)見性溫和刺激結(jié)合孤養(yǎng)(CUMS)的造模方法：各造模組大鼠均單籠飼養(yǎng)，刺激因子包括禁食、禁水、4℃冰水游泳、夾尾、晃尾、潮濕墊料和傾斜45°、束縛應(yīng)激、陌生物品、空籠刺激、噪音刺激、閃光刺激、水平震蕩、晝夜顛倒等。每日隨機(jī)給予2到3種刺激，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生以避免產(chǎn)生適應(yīng)。每種刺激交叉累計(jì)使用2-3次，持續(xù)21天，造模成功后，給藥期間繼續(xù)維持造模。建立慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)(CUMS)抑郁癥大鼠模型,具體操作方法如下：
(1)禁水：即24小時(shí)不予供水。具體方法為,造模當(dāng)天,上午8:00始,撤出大鼠籠內(nèi)供水瓶,禁水24小時(shí)后,于次日上午8:00正常供水。
(2)禁食：即24小時(shí)禁止進(jìn)食。具體方法為,造模當(dāng)天上午8:00始,清除鼠籠內(nèi)所有鼠糧,剝奪進(jìn)食24小時(shí)后,禁食期間供水正常。禁食后給少量碎食,然后正常詞養(yǎng).
(3)晝夜顛倒：造模當(dāng)天,上午8:00,將正常對照組大鼠轉(zhuǎn)移至其它SPF級實(shí)驗(yàn)室后,關(guān)閉本實(shí)驗(yàn)室所有電源,模仿黑夜,至20:00準(zhǔn)時(shí)打開實(shí)驗(yàn)室電源,模仿白晝,給大鼠制造晝夜顛倒的假象。
(4)夾尾：用纏裹有膠布的塑料夾,夾持鼠尾根部,時(shí)長為5min。
(5)晃尾：提住大鼠尾巴中部以每秒鐘1次的頻率,晃尾15分鐘,晃尾時(shí)力度要輕柔,避免牽拉大鼠尾尖部位,以防脫皮
(6)冰水游泳：取一直徑為30cm玻璃缸,注入適量清水后加入適量冰塊,調(diào)整水溫至4℃(根據(jù)天氣情況,適當(dāng)調(diào)整,以防凍傷),同時(shí)調(diào)整水液平面據(jù)器皿邊緣約15-20cm,然后將大鼠放入冰水中,強(qiáng)迫其游泳5min。5min后將大鼠榜出,先用干毛巾擦拭動(dòng)物毛發(fā),然后用吹風(fēng)機(jī)吹干,避免感冒。每次冰水游泳結(jié)束后需撈干凈游泳器皿內(nèi)大鼠類便,避免對下一只鼠產(chǎn)生影響。
(7)高速水平震蕩：將動(dòng)物放入空的鼠籠中，進(jìn)行人工振蕩，2 次/秒，有效節(jié)奏連續(xù)持續(xù) 5min;或者水平晃動(dòng)，1次/秒，持續(xù)30分鐘
(8)噪音刺激：90分貝噪音刺激2h，盡量選在白天大鼠休息的時(shí)候給予此種刺激。
(9)束縛刺激：將大鼠束縛于500ml燒杯中2h，注意保持通氣。
(10)潮濕環(huán)境：將大鼠的墊料換以潮濕墊料，持續(xù)刺激12h。
(11)異物刺激：往大鼠籠內(nèi)放置金屬條棒，鈍性玻璃器皿的異物予以刺激，持續(xù)2h。
(12)空 籠：撤掉大鼠籠里面的墊料籠子里不放置任何物品，持續(xù)12h。
(13)傾斜刺激,：該刺激因素通常在禁水后進(jìn)行,應(yīng)激動(dòng)物本身饑渴,在傾斜的鼠籠中覓食覓水更為困難。
(14)閃光刺激：LED頻閃燈，頻閃頻率2次/s，持續(xù)刺激2h。
以上各種刺激的實(shí)施順序遵循由弱(輕刺激,如晝夜顛倒、禁水禁食、潮濕環(huán)境)到強(qiáng)(重刺激,如冰水游泳,夾尾，晃尾，束縛刺激，噪音，閃光等刺激)的原則,以避免刺激之間的交互作用。每日采用1種刺激,平均每種刺激被采用2—3次,同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn),使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。
4.行為學(xué)指標(biāo)的測量
主要包括 1%蔗糖水消耗率、體重變化率、敞箱實(shí)驗(yàn)、Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)以及懸尾試驗(yàn)。
4.1體重變化率
分別在實(shí)驗(yàn)的第 1d、15d、22d、29、36d 、43d、50d、57、64d進(jìn)行。動(dòng)物體重變化率(%)=(當(dāng)日測量的體重-第1天的體重)/第1天的體重。
4.2糖水消耗實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備，在安靜的環(huán)境內(nèi)訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)含糖飲水：第一個(gè)24h，每籠同時(shí)放置兩個(gè)完全相同的動(dòng)物水瓶，兩瓶均為同等重量的1%蔗糖水;第二個(gè)24 h， 一瓶為1%鹿糖水,一瓶為相同重量的純凈水。然后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，禁水禁食24h后,測定9p.m-7a.m 10小時(shí)內(nèi)大鼠1%蔗糖水?dāng)z入量。糖水偏愛率% =糖水消耗量/(糖水消耗量+清水消耗量)X100%。適養(yǎng)期間進(jìn)行三次糖水偏愛篩選,將糖水偏愛率異常的大鼠剔除,不用于正式實(shí)驗(yàn)(三次糖水偏愛測試中均只喝自來水的大鼠為異常大鼠)。測定動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)第1天、第22天、第49天、第64天糖水偏愛率的變化。
4.3 敞箱實(shí)驗(yàn)
敞箱實(shí)驗(yàn)(Open-field Test )是評價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在陌生環(huán)境中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時(shí)間來反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自主行為與探究行為,以尿便次數(shù)反應(yīng)其緊張度。敞箱實(shí)驗(yàn)(Open-field Test):木質(zhì)敞箱,立方形,長、寬、高為80cm x 80cm x 40cm,內(nèi)側(cè)壁、底面為黑色,底面用白線劃分為面積相等的25塊正方形。室內(nèi)安靜環(huán)境下將大鼠放置于敞箱底面的中心方格內(nèi),人距離敞箱1米之外,記錄大鼠在3 min內(nèi)活動(dòng)頻率。以穿越底面正方形塊數(shù)為水平穿越格數(shù)(4爪均進(jìn)入方格才記數(shù),為水平運(yùn)動(dòng)得分)、以兩后肢直立的次數(shù)為豎立活動(dòng)次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁,為垂直運(yùn)動(dòng)得分),理毛次數(shù)以及大小便次數(shù)。每只動(dòng)物只測1次,測定完畢后徹底清潔敞箱再進(jìn)行下一只觀察。分別于實(shí)驗(yàn)前1天、實(shí)驗(yàn)第22天和最后1天進(jìn)行。
4.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)
該實(shí)驗(yàn)是對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測，主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用主要裝置包括一個(gè)銀灰色圓形水池(直徑 150cm)，一個(gè)白色平臺(tái)(直徑10cm)，一臺(tái)跟蹤攝像機(jī)以及與攝像機(jī)相連的計(jì)算機(jī)，池內(nèi)盛水，且水溫保持在 22-24℃。最后一次敞箱實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第二天開始，首先訓(xùn)練大鼠尋找平臺(tái)，平臺(tái)置于水面下 2cm，攝像機(jī)位于水池上方約 200cm，能清晰攝取到大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。將水池分為四個(gè)象限，將大鼠從任意一個(gè)象限放入水中，記錄其找到平臺(tái)的路徑及時(shí)間，前幾次訓(xùn)練中，若時(shí)間超過 120s，則引導(dǎo)動(dòng)物到平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留10s。然后進(jìn)行定位航行與空間搜索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練結(jié)束后的第一天，保持平臺(tái)位置不動(dòng)，將大鼠隨機(jī)從一個(gè)象限放入水中，開始記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡及找到平臺(tái)的時(shí)間;空間搜索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將平臺(tái)撤走，將動(dòng)物從原平臺(tái)位置的對側(cè)放入，開始記錄 120s 內(nèi)大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡及潛伏期與穿越平臺(tái)次數(shù)。以此做為對空間記憶能力的檢測指標(biāo)。
4.4 懸尾實(shí)驗(yàn)
將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過固定動(dòng)物尾端2cm處使其頭向下懸掛，動(dòng)物在該環(huán)境中拼命掙扎試圖逃跑又無法逃脫，從而提供了一個(gè)無可回避的壓迫環(huán)境，一段時(shí)間的實(shí)驗(yàn)后，記錄處于該環(huán)境的動(dòng)物產(chǎn)生絕望的不動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間。動(dòng)物表現(xiàn)出的這種典型的“不動(dòng)狀態(tài)”，反映了一種被稱之為“行為絕望狀態(tài)”，這種行為絕望模型與抑郁癥類似，而且對絕大多數(shù)抗抑郁藥物敏感，而且其藥效與臨床藥效顯著相關(guān)。
5.尼氏染色
正常的神經(jīng)細(xì)胞都含有一定數(shù)量的尼氏小體，它們主要分布于神經(jīng)細(xì)胞的漿中，形狀有大有小，如三角形，有的為橢圓形。這些物質(zhì)能被大部分的藍(lán)色染料所染色，這些染料如焦油堅(jiān)牢紫(Cresyl fast violet)、亞甲藍(lán)(methylene blue)、甲苯胺藍(lán)(toluidine blue)、硫董(thionin)等將其染為藍(lán)色。但是，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受傷后，胞質(zhì)內(nèi)的尼氏體更可發(fā)生變化，嚴(yán)重的可消失，通過觀察尼氏小體的數(shù)量可以探知神經(jīng)元的受損或修復(fù)情況。
各組大鼠分別于末次給藥后麻醉,使大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,打開腹腔,掀起右肺,在靠近脊柱處找出下腔靜脈和腹主動(dòng)脈。用止血鉗夾住腹主動(dòng)脈和下腔靜脈,接著打開胸腔,用針頭經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈,后剪開右心耳,進(jìn)行灌注。先用0.9%的生理鹽水250ml經(jīng)心臟快速灌注沖洗,再用4%的低聚甲醛,O.lmol/L的磷酸緩沖液(PH7.2-7.4)350ml灌注。在灌注固定液過程中后期大鼠頸部、肩部和雙前肢逐漸變硬。灌注后取大鼠全腦,10%低聚甲醛固定48-60h。以松果體為標(biāo)志物,向頭側(cè)橫向切取3段,每段厚2mm。石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚lOpin,切片,用于尼氏染色及后期的免疫組化。
將腦片置于0.5%甲苯胺藍(lán)(母液：甲苯胺藍(lán)1g，無水乙醇100ml。使用時(shí)按1:1比例與新鮮的0.1%NaCl溶液混合成工作液)或焦油紫(焦油紫0.1g;蒸餾水99ml;1%冰醋酸1ml)中室溫下染色30min。在75%、95%、100%酒精中各脫色1min，二甲苯透明10min，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察照相并對尼氏染色陽性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。
6.測量生化指標(biāo)
主要包括CREB、BDNF mRNA在大鼠海馬內(nèi)的表達(dá);免疫組化檢測TrKB、ERK1/2蛋白的表達(dá);免疫印跡法檢查CaM、CaMKⅡ的表達(dá)。
6.1逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測CREB、BDNFmRNA在大鼠海馬內(nèi)的表達(dá)
首先勻漿：海馬新鮮組織約100mg,加入1ml的TRIZOL試劑,用電動(dòng)勾漿器進(jìn)行勾漿;兩相分離:分裝后樣品于15到30℃孵育5分鐘。每1ml的TRIZOL試劑勾漿的樣品中加入0.2 ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后,15-30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000 g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色紛氯仿相,中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中,水相的體積大約是勾漿時(shí)加入的TRIZO試劑的60%;RNA沉淀:將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA,加入異丙醇的量為每個(gè)樣品勻漿時(shí)加入，1mlTRIZOL試劑加0.5 ml的異丙醇，混勾后15-30℃孵育10分鐘后,于4℃ 12,000g離心10分鐘;RNA清洗:移去上清液,每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75%乙醇,清洗RNA沉淀。振蕩后,4℃，7500g離心5分鐘;重新溶解RNA況淀:去除乙醇溶液,空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘,切勿真空離心干燥，注意RNA沉淀不要完全干燥,否則將大大降低RNA的可溶性，部分溶解的RNA樣品A260/280比值將小于1.6;溶解RNA時(shí),先加入無RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾次,然后55-60℃孵育10分鐘。莰得的RNA溶液保存于-70℃;濃度測定:取少量液體用TE稀釋(一般1: 100稀釋)后,讀取其在紫外分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,A260下讀值為1表示40ugRNA/ml;樣品RNA濃度(ug/ml)=A260×稀釋倍數(shù)40ug/ml;RNA純度檢測:RNA溶液的A260/A280的比值范圍應(yīng)在1.8-2.1之間;
在無核酸酶的離心管中配制反應(yīng)液： RNA，1-5μg;逆轉(zhuǎn)錄引物 (20um)，1μl;RNase free H2O，使總體系為12.5μl(反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行)。輕輕混勻,65℃變性10min，立即置于冰上2min后加入：RNA-primer mix，12.5μl;5×RT Reaction Buffer ，4μl;dNTP(10mM)，2μl;RiboLock RNase Inhibitor ，0.5μl;RevertAid Reverse Transcriptase，1μl�？傮w系20μl，25℃孵育10min后42℃孵育60min，70℃加熱滅活10 min，-20℃保存。
設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，配制成合適濃度工作液，Real time-PCR儀反應(yīng)體系液配制：2X all-in-OneTM qPCR Mix(含ROX)，10μl;引物(10pmol/μl)，上下游各0.4μl;ddH2O，4.2μl;cDNA(適度稀釋)，5μl�？傮w系20μl。反應(yīng)條件：95℃，10min,以下反復(fù)40個(gè)循環(huán);95℃,10s;60℃，20s;72℃，20s。最后結(jié)果采用2-ΔΔCT法進(jìn)行測量。
6.2免疫組化法檢測TrKB、ERK1/2的表達(dá)
切片后,常規(guī)脫蠟至水;3%過氧化氫孵育lOmin,可以滅活內(nèi)源性酶的活性,蒸水沖洗,5minx3次;微波熱修復(fù)3min,PBS沖洗,5minx3次;滴加5%BSA封閉液,室溫孵育30min;滴加一抗,5-HTiaR 一抗稀釋為1:50,PKA稀釋為1:100,CREB稀釋為1:100,4°C過夜,PBS沖洗,5minx3次;滴加二抗生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,37°C孵育30min,PBS沖洗,5minx3次;滴加三抗試劑SABC,37°C孵育30min,PBS沖洗,5minx3次;DAB顯色劑顯色,室溫下15inin,蒸饋水沖洗,脫水,透明,封片最后DAB 顯色劑顯色，室溫下20min，蒸餾水終止反應(yīng)，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。每只動(dòng)物取相同部位的3張切片，每張切片選取3個(gè)視野，在同一放大倍數(shù)、同一光強(qiáng)度下，采用CMLAS 彩色病理圖像分析系統(tǒng)，分別計(jì)算每張切片中海馬組織TrKB、ERK1/2表達(dá)的平均光密度。
6.3免疫印跡法測定鈣調(diào)素(CaM)、鈣調(diào)蛋白激酶(CaMKⅡ)蛋白表達(dá)變化
取新鮮海馬約100mg置1.5mlEP管中，生理鹽水沖洗兩遍，充分剪碎，離心去上清。每管加4℃裂解液1ml，繼續(xù)剪碎、混勻，低溫超聲勻漿;14000轉(zhuǎn)離心，5min，取上清備用。取上清5μl，加考馬斯亮藍(lán)3μl，去離子水95μl，595nm 處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管OD值;根據(jù)樣品OD值調(diào)整蛋白濃度。樣品煮沸5min，冷卻后取50μg上樣;電件(12%濃縮膠：90v30min;10%分離膠：120v120min);NC膜轉(zhuǎn)印(70v120min);5%脫脂奶粉TBST溶液封閉抗體，搖床2h，TBS漂洗5min，3次。一抗孵育(兔抗人CaM、CaMKⅡ多克隆抗體1:500稀釋)，4℃過夜;二抗孵育(辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG 1:1500稀釋)，37℃ 1h;掃描并分析結(jié)果，條件設(shè)置為曝光2min，CCD自動(dòng)獲取圖像，同時(shí)以1:1000稀釋的小鼠抗大鼠beta-actin單克隆抗體作為內(nèi)參照，各蛋白相對表達(dá)量以相應(yīng)蛋白/beta-actin灰度值表示。
七 可行性分析
1. 前期研究基礎(chǔ)：本項(xiàng)目的前期工作已經(jīng)成功復(fù)制了CUMS抑郁癥動(dòng)物模型，證實(shí)了百合知母湯能增加抑郁癥動(dòng)物3分鐘穿格數(shù)、3分鐘直立次數(shù)、修飾次數(shù)、大便粒數(shù)等行為學(xué)指標(biāo);能提高腦組織CREBmRNA的表達(dá)水平。為本課題的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
2. 人員配備及實(shí)驗(yàn)設(shè)施基礎(chǔ)：本課題思路清晰、目標(biāo)明確。擬在湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北中醫(yī)藥大學(xué)“中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”“國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級實(shí)驗(yàn)室”實(shí)施，實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備和人員配備完善，具備藥理學(xué)、藥物化學(xué)和分子生物學(xué)研究的相關(guān)設(shè)備與精密儀器，能滿足本申請項(xiàng)目使用需要。
3. 本課題所需的實(shí)驗(yàn)條件，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室均具備。
4. 本課題所涉及的主要技術(shù)和方法已初步掌握。
5. 實(shí)驗(yàn)所需試劑均可在國內(nèi)夠得。
八 課題創(chuàng)新性
1. 本課題首次系統(tǒng)地由宏觀到微觀地進(jìn)行綜合研究，能從行為學(xué)水平→細(xì)胞形態(tài)水平→分子水平三個(gè)層次經(jīng)行分析，以期待比較完善地探索百合知母湯抗抑郁功效及其機(jī)理。
2. 本課題選用了先進(jìn)的指標(biāo)，并且采用蛋白水平和mRNA水平檢測方法，檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子及相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵因子的變化，以期探尋本方提高抑郁癥大鼠腦組織CREBmRNA的表達(dá)水平的進(jìn)一步信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
九 預(yù)期結(jié)果
1. 成功完成大鼠抑郁癥CUMS模型的建立，構(gòu)建良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
2. 探討百合知母湯抗抑郁機(jī)制中三種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮的作用，篩選百合知母湯抗抑郁的靶點(diǎn)通路。
3. 預(yù)計(jì)在國內(nèi)學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文2篇。
參考文獻(xiàn)
[1]吳炫靜. 抑郁癥的中醫(yī)辨證治療研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院. 2008:15-23.
[2]孫旭海.中醫(yī)精神疾病分類與癥狀的古代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)整理研究[D].北京:中國中醫(yī)科學(xué)院. 2007: 1-2.
[3]吳崇勝. 抑郁癥中醫(yī)癥候診斷標(biāo)準(zhǔn)研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué). 2006:19-21.
[4]Nemeroff CB. The neurobiology of depression[J]. Scientific American， 1998， 278:42.
[5]周學(xué)東，陳興寶.抑郁癥經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)研究進(jìn)展[J].上海醫(yī)藥，2006， 27(12):539-541
[6]周庚生，胡紀(jì)明.中西醫(yī)臨床精神病學(xué)，中國中醫(yī)藥出版社，1998:316
[7]湯久慧. 中醫(yī)藥抗抑郁實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀[J]. 河南中醫(yī)， 2014， 34(7): 1248-1250
[8]張麗萍，顏紅，侯冬芬.心身醫(yī)學(xué)中醫(yī)研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27(3)：206-208.
[9]Andrade L, Caraveo-duaga JJ, Berglund P, et al. The epidemiology of major depressive episodes:results from the International Consortium of Psychiatric Epideraiology(ICPE)Surveys[J]. International Journal of Methods in Psychiatric Research,2003, 12:3-21
[10]Kessler RC. Epidemiology of depression in the Asia pacific region[J]. Australasian Psychiatry,2004, 12(suppl):4-10
[11]Kessler RC. Epidemiology of women and depression[J], Journal of Affective
Disorders' 2003, 74:5-13
[12]嚴(yán)和駿,肖世富,陸余芬,等.綜合性醫(yī)院就診者的心理障礙[J].上海精神醫(yī)學(xué),1996,8:65-68
[13]余殿飛,謝銅華.戰(zhàn)勝人類第一心理殺手:抑郁癥的早期認(rèn)識(shí)和有效防治[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2001:28
[14]Jasinska AJ, Lowry CA,Burmeister M. Serotonin transporter gene, stress and raphe-raphe interactions: a molecular mechanism of depression[J]. Trends in neurosciences. 2012;35(7):395-402.
[15]Tang SW, Helmeste D, Leonard B. Is neurogenesis relevant in depression and in the mechanism of antidepressant drug action A critical review[J], The world journal of biological psychiatry : the official journal of the World Federation of Societies of Biological Psychiatry. 2012; 13(6):402-12.
[16]Pitychoutis PM,Dalla C,Sideris AC,Tsonis PA,Papadopoulou-Daifoti Z. 5-HT(l A),5-HT(2A),and 5-HT(2C) receptor mRNA modulation by antidepressant treatment in thechronic mild stress model of depression: sex differences exposed[J]. Neuroscience. 2012 May 17;210:152-67.
[17]Guenther U,Theuerkauf NU, Huse D,Boettcher MF,Wensing G,Putensen C.Selective 5-HT(1 A)-R-agomst repinotan prevents remifentanil-induced ventilatoiy depression and prolongs antinociception[J]. Anesthesiology. 2012;116(1):56-64.
[18]張獲緩.抑郁大昆不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)變化的研究.北京,中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院,2009.
【中醫(yī)專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告】相關(guān)文章：
土木專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告06-09
體育專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告07-21
2017經(jīng)管專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告12-29
英語專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告11-03
畢業(yè)論文開題報(bào)告06-18
畢業(yè)論文開題報(bào)告06-19
畢業(yè)論文的開題報(bào)告06-18
信息與計(jì)算科學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告07-17