臨床本科畢業(yè)論文

時間：2021-02-27 13:13:43 畢業(yè)論文范文我要投稿

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　　題目：紅芪多糖的純化及初步結構鑒定

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　　論文摘要：目的研究紅芪多糖的分離純化及初步的結構。方法采用超聲輔助提取多糖，比較 Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白的效果，并用 GC、TLC及 IR分析多糖的初步結構。結果三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白，經 Sephadex G-25柱層析分離純化后得紅芪多糖2(HPS-2)，HPLC確定為均一多糖，糖含量為 98.2%，糖組成分析表明其含有鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為 .3∶.2∶2.7∶16.1∶2.。結論HPS-2是一種以 β苷鍵為主的吡喃型雜多糖。

　　論文關鍵詞：紅芪多糖; 薄層色譜; 結構鑒定

　　紅芪(Radix Hedysari)，為豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪Hedysarumpolybotrys Hand.-Mazz的干燥根，為甘肅特產名貴藥材，在臨床上主要用于補氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌。紅芪中含有氨基酸、有機酸、β-谷甾醇、紅芪多糖、微量元素等眾多的生物活性物質[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，紅芪多糖的活性成分具有增強機體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、治療糖尿病等作用[1，2]。特別是我們近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，經 7%乙醇沉淀部分藥理作用尤為明顯。由于多糖為大分子化合物，分離純化比較困難，而蛋白質的脫除是后期結構鑒定的關鍵之一，為了提高多糖的得率、純度及活性，本實驗對這部分多糖進行了脫蛋白方法的研究，結合TLC、GC、IR等方法對 HPS-2 的結構進行了初步的`分析，以期為紅芪多糖的進一步研究提供理論基礎。

　　1 材料與儀器

　　紅芪，購自甘肅武都;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍 G-25(西安周鼎國生物技術有限責任公司);單糖對照品(中國藥品生物制品檢定所);Sephadex G-25(上海長征制藥廠);硅膠 G(青島海洋化工廠);其它試劑均為分析純。

　　CR22G Ⅱ型離心機(日本日立);UV-17 型紫外儀(日本島津);GC-Clarus 5型氣相色譜儀(美國 PerkinElmer公司);紅外光譜儀(Nicolet NEXUS 67);BS-1A 自動部分收集器、HL-2 恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司);美國Waters6型高效液相色譜儀，配 Waters2414型示差折光檢測器。

　　2 方法

　　2.1 紅芪多糖的提取純化路線其流程如下。

　　2.1.1 提取紅芪藥材→粉碎→超聲脫脂→熱水提取3次→合并提取液→減壓濃縮后離心→取上清液→乙醇沉淀→有機溶劑洗劑→透析→減壓濃縮→冷凍干燥得粗多糖 HPS。

　　2.1.2 純化粗多糖液→脫蛋白、色素→Sephadex G-25柱層析→洗脫液透析→濃縮→冷凍干燥→精制紅芪多糖 HPS-2。

　　2.2 蛋白質和多糖含量的測定蛋白質含量測定采用考馬氏亮藍法[3]，多糖含量采用苯酚-硫酸法[4]。

　　2.3 脫蛋白方法

　　稱取一定量的粗多糖，加入適量蒸餾水，6℃加熱溶解，備用。本實驗采用 3種脫蛋白的方法。

　　2.3.1 Sevag法取粗多糖溶液，加入等體積的氯仿-正丁醇(V/V為 4∶1)試劑，混合振搖 3 min，離心除去沉淀，透析后醇沉，冷凍干燥，即得脫蛋白多糖。

　　2.3.2 三氯乙酸法取粗多糖溶液，加入多糖溶液體積 .1倍量的三氯乙酸，低溫(4℃)劇烈振搖 3 min，離心除去沉淀，透析后醇沉，冷凍干燥，即得脫蛋白多糖。

　　2.3.3 三氯乙酸-正丁醇法

　　取粗多糖溶液，加入等體積的三氯乙酸-正丁醇(V/V為 1∶1)試劑，振蕩 1 min，靜置分層，收集下層水溶液，透析后醇沉，冷凍干燥，即得脫蛋白多糖。

　　2.4 紅芪多糖的精制將一定量的脫蛋白多糖，溶解于適量蒸餾水中。過氧化氫除色素，減壓濃縮，經醇沉、離心、冷凍干燥得紅芪多糖1(HPS-1)，取適量的 HPS-1，蒸餾水溶解后，Sephadex G-25柱分離，蒸餾水洗脫，流速 .8 ml/min，每 3 ml收集1份，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，繪制洗脫曲線，合并主峰流出液，減壓濃縮至一定體積，冷凍干燥得 HPS-2。

　　2.5 純度鑒定用 HPLC法，TSK-gel G25PW色譜柱，示差折光檢測器，流動相為雙蒸水，流速 1. ml/min，檢測器溫度35℃，樣品濃度4 mg/ml，進樣量5 μl。同時取該樣品溶液在 2～4 nm范圍內進行紫外掃描。

　　2.6 氣相色譜參照文獻[5]，多糖樣品經徹底水解后制備糖腈乙酸酯衍生物，以單糖的糖腈乙酸酯衍生物為對照品進行 GC分析。色譜條件: OV-11毛細管柱(5 m×. 32 mm)，載氣為N2 ，流速 5 ml/min，分流比 4∶1，F(xiàn)ID氫火焰檢測器，汽化室溫度 25℃，檢測器溫度 28℃。程序升溫:11℃(保持 5 min)→(5℃/min)→ 28 ℃(保持 2 min)。進樣量 .4 μl。

　　2.7 薄層色譜[6]取 15mg HPS-2，三氟醋酸徹底水解，水解產物溶于 1 ml蒸餾水中，以標準單糖為對照，分別取樣品水解液和單糖對照液在含磷酸二氫鈉的硅膠G薄層板上點樣，上行二次展開，展開劑: 醋酸乙酯∶冰醋酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2(V/V);自然風干后顯色，顯色劑: 苯胺-鄰苯二甲酸溶液，烘箱中 15 ℃加熱 5～1 min顯色。

　　2.8 紅外光譜測定取 2 mg HPS-3，KBr壓片，測定紅外光譜。

　　3 結果

　　3.1 脫蛋白方法的選擇以蛋白脫除率和多糖損失率為指標，比較 Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法的脫蛋白效果(見圖1)。Sevag法的多糖損失率最低，但脫蛋白率也最低;三氯乙酸-正丁醇法的脫蛋白率最高，多糖損失率最低;三氯乙酸法的脫蛋白率達 3%以上，但多糖損失最高。綜合各方面的因素，本實驗選取三氯乙酸-正丁醇法脫除紅芪多糖中的蛋白質。

　　3.2 紅芪多糖分離純化紅芪多糖經Sephadex G-25柱層析純化分離的洗脫曲線(見圖2)。僅出現(xiàn) 1個洗脫峰，收集主峰，透析，濃縮，冷凍干燥，得到 HPS-2。

　　3.3 純度鑒定HPS-2的紫外掃描在 26～28nm處吸收峰消失，茚三酮反應呈陰性，說明樣品中的蛋白質基本除盡，也無核酸存在;碘-碘化鉀反應呈陰性，表明樣品為非淀粉多糖;經 HPLC凝膠色譜后為單一對稱峰。表明其為均一組分;苯酚-硫酸法測定 HPS-2的糖含量為 98.6%。

　　3.4 紅芪多糖的結構分析

　　3.4.1 氣相色譜分析

　　氣相色譜分析(見圖 3)。比較標準品和樣品的保留時間，可見多糖 HPS- 2由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖5種單糖組成。其摩爾組成比例為 .3∶.2∶2.7∶16.1∶2.。

　　3.4.2 薄層色譜分析HPS-2 經薄層色譜(見圖 4)。檢出半乳糖(Rf對=Rf樣=.4)、葡萄糖(Rf對=Rf樣=.3)、阿拉伯糖(Rf對=.2，Rf樣=.19)、木糖(Rf對=Rf樣=.62)和鼠李糖(Rf對=Rf樣=.77)，其中木糖和鼠李糖含量較低，斑點不明顯。這與氣相色譜結果一致。

　　3.4.3 紅外分析從IR譜圖由圖 5可見，HPS-2在 3 6～3 2 cm-1、3 ～2 8 cm-1和 1 4～1 2 cm-1處均具有多糖的特征吸收峰。1 154、1 8、1 24 cm-1處為 β-吡喃糖基的振動峰[7];898 cm-1為 β-糖苷鍵的吸收峰，82 cm-1處為 α-吡喃糖的吸收峰，說明多糖 HPS-2中存在 α和 β兩種類型的苷鍵，并以吡喃型糖為主。

　　4 結論

　　本實驗比較了3種脫蛋白方法，三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白效果最好，脫除率達 37.2%，多糖損失率少。利用葡聚糖凝膠 Sephadex G-25柱層析分離純化紅芪多糖得 HPS-2，經 HPLC及紫外掃描為均一多糖，不含蛋白質和核酸。

　　GC、TLC及 IR分析 HPS-2的糖基組成和結構為，主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖5種單糖組成，其摩爾比為 .3∶.2∶2.7∶16.1∶2.，單糖主要為吡喃糖，異頭碳以 β型為主，并有少量的 α型。這為紅芪多糖的深入研究打下了理論基礎，特別為其組成的快速分析提供了可靠的方法。

　　參考文獻

　　[1]權菊香. 紅芪的藥理研究進展[J]. 時珍國藥研究，1997，8(2):178.

　　[2]金智生，汝亞琴. 中藥紅芪的實驗研究進展[J].甘肅中醫(yī)學院學報，23，2(4):52.

　　[3]李知敏，王伯初，周菁，等. 植物多糖提取液的幾種脫蛋白方法的比較分析[J].重慶大學學報，24，27(8):57.

　　[4]董群，鄭麗伊，方積年. 改良的苯酚-硫酸法測定多糖和寡糖含量的研究[J].中國藥學雜志，1996，31:55.

　　[5]康學軍，曲見松. 白芷多糖中單糖組成的氣相色譜分析[J].藥物分析雜志，26，26(7):891.

　　[6]張維杰.復合多糖生化研究技術[M].上海:上�？茖W技術出版社，1987:1.

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