高能X射線對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞ERCC1表達(dá)的影響論文

　　【關(guān)鍵詞】 肺腫瘤；a549細(xì)胞；切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1；x線療法

　　【摘要】   目的 檢測(cè)高能x射線對(duì)肺腺癌a549細(xì)胞與順鉑耐藥相關(guān)的基因——切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ercc1）表達(dá)的影響。方法 對(duì)a549細(xì)胞進(jìn)行x射線照射，總劑量10 gy／(5 d·5f)。利用rt瞤cr檢測(cè)照射前及照射開始后第1～4周細(xì)胞的ercc1基因的表達(dá)；免疫組織化學(xué)sabc法檢測(cè)照射前后細(xì)胞ercc1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 照射后第1～3周a549細(xì)胞ercc1 mrna及蛋白的表達(dá)水平比照射前顯著升高，差異有顯著性(f=152.00、26.63,q=6.03～28.31,p<0.01)。結(jié)論 肺腺癌a549細(xì)胞照射后可能出現(xiàn)順鉑耐藥。

　　effect of high瞖nergy x瞨ay on ercc1 expression in lung adenocarcinoma a549 cells

　　wang yu瞗ang, liu xi瞘uang, yin hong瞞ei, et al

　　(department of oncology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);

　　［abstract］ objective to study the high瞖nergy x瞨ay on expression of ercc1 gene associated with cisplatin resistance in human lung adenocarcinoma a549 cell. methods the a459 cells were exposed to x瞨ay with a total dose of 10 gy/(5 d·5 f). the expression of ercc1 before and during 1-4瞱eek radiation was detected by rt瞤cr, and that before and after exposure of x瞨ay was detected by immunohistochemistry (sabc method). results on the first to third week of irradiation, the expressions of ercc1 mrna and protein were significantly higher than that before exposure (f=152.00,26.63;q=6.03-28.31;p<0.01). conclusion a549 cells may show cisplatin resistant after radiation.

　�。踜ey words］ lung tumor; a549 cell; excision repair cross瞔omplementation group 1; x瞨ay therapy

　　肺癌是世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（nsclc）約占80％，而約2/3的nsclc病人在發(fā)現(xiàn)時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)， 故放化療綜合治療已成為該類腫瘤常用的治療手段。Www.133229.COm再次或多次化療可以誘導(dǎo)多藥耐藥導(dǎo)致腫瘤的化療敏感性降低已無異議，但目前關(guān)于放療后耐藥基因及其蛋白表達(dá)情況以及相應(yīng)的放療對(duì)化療敏感性的影響方面的研究較少,結(jié)果也不一致。因此，有針對(duì)性地對(duì)其研究十分必要。目前含鉑方案是nsclc一線標(biāo)準(zhǔn)化療方案。研究結(jié)果證實(shí)，ercc1可作為鉑類藥物化療效果的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[15]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)體外培養(yǎng)的肺腺癌a549細(xì)胞株,檢測(cè)高能x射線照射前后與順鉑耐藥相關(guān)的`基因——切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ercc1）及其編碼產(chǎn)物的表達(dá)隨時(shí)間變化情況，探討照射與肺腺癌a549細(xì)胞順鉑耐藥性的關(guān)系�，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

　　1 材料與方法

　　1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

　　人肺腺癌細(xì)胞株a549由中國科學(xué)院上海生物學(xué)研究所提供。培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)0.10的小牛血清、10×104u/l的青霉素及10×104 g/l鏈霉素的rpmi 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 co2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行x射線照射。

　　1.2 照射方法

　　照射源為直線加速器(varian 23ex，美國)，采用6 mv的x射線，源皮距為100 cm。細(xì)胞每次照射劑量為2 gy，每天1次，總劑量10 gy。劑量率為300 cgy/min。射野大小為15 cm×15 cm。把培養(yǎng)瓶置于照射野中心，每次照射后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，全部照射結(jié)束后，每隔1周取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞凍存，用于rt瞤cr和sabc法檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

　　1.3 rt瞤cr檢測(cè)ercc1 mrna的表達(dá)

　　按trizol試劑盒(購自美國invitrogen公司)說明書及rt瞤cr試劑盒（購于大連寶生物工程有限公司）說明書的方法提取總細(xì)胞rna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna。ercc1引物序列為：正向引物5′瞐ccc瞔tcgacgaggatga3′,反向引物 5′瞘atggc瞐tattcggcgtaggt3′，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為127 bp。內(nèi)參照β瞐ctin擴(kuò)增片段長(zhǎng)約為621 bp， 引物序列為：前向引物5′瞐cactgtgcccatctacgagg勃3′， 反向引物5′瞐gggccggactcgtcatact3′。上述ercc1及內(nèi)參照β瞐ctin引物均由上海生工生物工程有限公司合成。逆轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為：37 ℃ 5 min后，42 ℃ 1 h，72 ℃ 10 min。pcr反應(yīng)體系為50 μl，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;然后94 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃ 復(fù)性65 s，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃充分延伸10 min后終止反應(yīng)。取產(chǎn)物于15 g/l的 瓊脂糖凝膠上電泳。以β瞐ctin作為內(nèi)標(biāo)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)為621 bp，將標(biāo)本的ercc1擴(kuò)增產(chǎn)物平均吸光度與內(nèi)標(biāo)的平均吸光度值相比，以比值作半定量分析。

　　1.4 ercc1蛋白表達(dá)sabc法檢測(cè)

　　x射線照射前對(duì)未進(jìn)行處理的肺腺癌a549細(xì)胞，直接用免疫組織化學(xué)sabc法檢測(cè)ercc1蛋白的表達(dá)。細(xì)胞株在x射線照射后經(jīng)換液、傳代在1～4周檢測(cè)ercc1蛋白的表達(dá)。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，鼠抗人ercc1單抗試劑盒(labvision，美國)為1∶50濃縮液。 ercc1陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀。照射前及照射后各時(shí)間點(diǎn)各選1張細(xì)胞分布比較均勻、細(xì)胞稠密適當(dāng)?shù)募?xì)胞爬片。每張爬片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率。

　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　采用ppms 1.5[6]統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得數(shù)據(jù)均以±s表示，各組間兩兩比較采用lsd瞭檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1 rt瞤cr檢測(cè)ercc1 mrna表達(dá)

　　照射前及照射1～4周ercc1 mrna表達(dá)分別為0.21±0.04、0.43±0.03、0.70±0.02、0.52±0.03和0.20±0.06，照射后第1～3周細(xì)胞ercc1 mrna的表達(dá)水平比照射前顯著升高，差異有顯著性(f=152.00,q=12.76 ～28.31,p<0.01)。第4周與照射前相比差異無顯著性（p>0.05）。

　　2.2 sabc法檢測(cè)ercc1蛋白的表達(dá)

　　照射前及照射1～4周ercc1蛋白的表達(dá)分別為（33.02±7.55）%、（51.02±8.59）%、（71.96±6.50）%、（59.33±7.00）%及(39.96±5.42)%，照射后第1～3周細(xì)胞ercc1蛋白的表達(dá)與照射前比較，差異有顯著性(f=26.63，q=6.03～13.06，p<0.05)。照射后4周時(shí)，與照射前比較差異無顯著性(p>0.05)。

　　3 討論

　　ercc1是一種高度保守的單鏈dna核酸內(nèi)切酶，位于染色體19q13.213.3，基因長(zhǎng)度約為15 kb，其含有10個(gè)外顯子，編碼含297個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。ercc1基因表達(dá)產(chǎn)物與dna修復(fù)酶缺乏互補(bǔ)基因f(xpf)形成緊密異二聚體(ercc1瞲pf)，該二聚體是一種特異性的連結(jié)5′端的核酸內(nèi)切酶，具有損傷識(shí)別和切除5′端的雙重作用。研究結(jié)果顯示，nsclc中存在ercc1表達(dá)，表達(dá)率為35％(22/63)[7]，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似。說明該細(xì)胞本身就對(duì)順鉑有低度耐藥。照射后，細(xì)胞ercc1 mrna及蛋白表達(dá)在一定時(shí)間內(nèi)均比照射前顯著增高，說明放射治療也可引起肺腺癌a549細(xì)胞的順鉑耐藥，因此應(yīng)注意放射治療對(duì)腫瘤化療耐藥的影響。其機(jī)制可能與照射后ercc1表達(dá)增高與照射引起的dna損傷后修復(fù)有關(guān)。照射一定時(shí)間后ercc1基因及蛋白表達(dá)又有回落，提示應(yīng)避免在耐藥基因及蛋白表達(dá)水平較高時(shí)給予化療藥物治療，避免因放療誘導(dǎo)的順鉑耐藥，降低腫瘤綜合治療效果。另一方面提示放療聯(lián)合ercc1 mrna的靶向治療可能會(huì)取得更理想的抗腫瘤效應(yīng)。

　　鉑類和第三代抗腫瘤新藥，如紫杉醇、多西紫杉醇、鹽酸吉西他濱的二聯(lián)作為目前腫瘤一線標(biāo)準(zhǔn)化療方案，但并不代表為最合理的治療方案。標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療晚期nsclc病人療效差異較大，基于分子分型基礎(chǔ)上的個(gè)體化化療是目前研究熱點(diǎn)之一。藥物基因組學(xué)研究的個(gè)體化用藥選擇，是肺癌個(gè)體化治療研究的前沿，不同藥物效應(yīng)預(yù)測(cè)分子可影響肺癌對(duì)不同化療藥物的反應(yīng)。目前幾組根據(jù)不同相關(guān)藥物效應(yīng)預(yù)測(cè)分子，如ercc1、rrm1、β2參⒐艿鞍注１澩鎪平選擇不同化療方案的ⅲ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。我們實(shí)驗(yàn)室也正在并陸續(xù)研究了放療后β2參⒐艿鞍注！rrm1、xpd、xrcc1、brca1等的表達(dá)，以進(jìn)一步指導(dǎo)放療后個(gè)體化治療。

　　當(dāng)然，本研究畢竟只是體外實(shí)驗(yàn)，旨在對(duì)臨床體內(nèi)治療的方案提供理論參考，考慮到癌細(xì)胞組織來源不同，細(xì)胞體內(nèi)外生存環(huán)境的不同，照射方式、選取檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)、檢測(cè)指標(biāo)的不同，體內(nèi)腫瘤病灶受病人的身體狀況、腫瘤的病理類型、病期等影響。照射后其耐藥基因及蛋白的表達(dá)程度可能也存在一定的差異。這些問題尚待進(jìn)一步研究。

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