分析榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠造成的影響論文
骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性進行性骨關(guān)節(jié)功能與結(jié)構(gòu)退行性疾病，屬于臨床常見病，目前尚缺乏有效的根治措施，作為非手術(shù)療法的中醫(yī)藥在治療慢性退行性疾病過程中顯示出獨特的療效而日益受到人們的重視。OA 屬于中醫(yī)“痹證”的范疇，多因腎氣虧虛、關(guān)節(jié)失養(yǎng)，復(fù)受風寒濕邪，氣血痹阻，經(jīng)絡(luò)不暢而發(fā)，治則為補益肝腎、活血通絡(luò)、祛風散寒、勝濕止痛。在上述中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下形成的榮骨定痛膏在臨床上取得了較好的療效。本研究通過復(fù)制OA大鼠模型，考察榮骨定痛膏對OA 大鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能、關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性細胞以及對血清白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的影響，探討榮骨定痛膏防治OA 的作用及機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 藥物與試劑
榮骨定痛膏(靖遠縣中醫(yī)院，批號：20140610，每毫升軟膏劑含原生藥1.5 g);鹽酸氨基葡萄糖膠囊(浙江誠意藥業(yè)有限公司，批號：20130603，規(guī)格：240 mg);木瓜蛋白酶(美國Sigma 公司，批號118K1461);IL-1β(批號：20140608)、IL-6(批號：20140608)與TNF-α(批號：20140501)試劑盒均購于北京華英生物技術(shù)研究所。
1.2 動物與分組
SPF 級，♂，SD 大鼠，體質(zhì)量180~220 g，質(zhì)量合格證號：62001000000033，由甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供， 動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘)2011-0001。SPF 級實驗室，許可證號：SYXK(甘)2011-0001。48 只SD 大鼠，隨機分為6組，即正常對照組，模型對照組，氨基葡萄糖組(90 mg·kg?1)，榮骨定痛膏高、中、低劑量組(120，60，30 mg·d?1)。
1.3 儀器
TGL-16G 高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠);N-5600PC 型METASH 可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);HH-S 型恒溫水浴鍋(金壇市正基儀器有限公司);BS1103 電子天平(北京賽多里斯有限公司)。
1.4 造模與給藥
各組大鼠膝關(guān)節(jié)周圍及上下0.5 cm 處皮膚脫毛，參照相關(guān)實驗方法[3-4]，在造模的第1，3，7天，將4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液50 μL 注入大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，正常對照組注射等量生理鹽水。造模的同時給藥，榮骨定痛膏高、中、低劑量組在大鼠膝關(guān)節(jié)及上下0.5 cm 處涂抹不同濃度(1.500，0.750，0.375 g·mL?1)的榮骨定痛膏40 μL(即60，30，15 mg)，氨基葡萄糖組灌胃0.9%氨基葡萄糖5 mL·kg?1(即45 mg·kg?1)，正常對照組與模型對照組膝關(guān)節(jié)涂抹蒸餾水，2 次·d?1，連續(xù)5 周。
1.5 指標檢測
末次涂藥2 h，麻醉大鼠后測量被動膝關(guān)節(jié)活動度;之后采血，測定IL-6、IL-1β 與TNF-α 的水平;取血后處死大鼠，抽提關(guān)節(jié)腔灌洗液，離心，取其沉淀混懸液制片，在光鏡下分類計數(shù)炎性細胞并對其進行半定量分析;刮取關(guān)節(jié)面上的滑膜組織，測定關(guān)節(jié)滑膜厚度。
1.6 統(tǒng)計學處理
采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用x ? s表示，組間比較采用單因素方差分析，半定量資料采用Ridit 分析，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
2.1 榮骨定痛膏對OA 大鼠膝關(guān)節(jié)活動范圍及關(guān)節(jié)滑膜厚度的影響與正常對照組比較，大鼠膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶35 d 后，膝關(guān)節(jié)的活動范圍明顯縮窄，關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度明顯增加(P<0.01);與模型對照組比較，經(jīng)榮骨定痛膏防治后，膝關(guān)節(jié)的活動范圍擴大，關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度明顯減小(P<0.05 或0.01);與榮骨定痛膏低劑量組比較，榮骨定痛膏高劑量組的防治作用更強(P<0.05)，顯示出一定的量效關(guān)系。
2.2 榮骨定痛膏對OA 大鼠關(guān)節(jié)液中炎性細胞的影響對關(guān)節(jié)灌洗沉淀混懸液中的炎性細胞數(shù)目分級結(jié)果顯示，與正常對照組比較，注射木瓜蛋白酶后關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性細胞明顯增加(P<0.01);與模型對照組比較，經(jīng)榮骨定痛膏治療后，關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性細胞數(shù)有所減少，其中榮骨定痛膏高劑量組差異有顯著性(P<0.05)。
2.3 榮骨定痛膏對OA 大鼠模型血清細胞因子的影響與正常對照組比較，OA 模型大鼠血清IL-1β、IL-6 與TNF-α 均明顯升高(P<0.01);與模型對照組比較，經(jīng)榮骨定痛膏防治后，IL-1β、IL-6 與TNF-α均不同程度地下降(P<0.05 或0.01)。
3 討論
OA 發(fā)病率隨年齡的增長而升高，隨著我國社會人口結(jié)構(gòu)的迅速老齡化，該病發(fā)病率逐年增加。該病不僅是公共衛(wèi)生問題，也成為社會問題，日益引起人們的重視。OA 的發(fā)病機制非常復(fù)雜，但其基本病理變化為關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變與關(guān)節(jié)的增生性改變(特別是軟骨周圍及滑膜處)。目前臨床上尚缺乏有效的根治措施，手術(shù)治療又缺乏確切有效的臨床治療方案，作為非手術(shù)療法的中醫(yī)藥治療日益受到人們的`重視。
在OA 的發(fā)病過程中，炎癥細胞及促炎性細胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 等是參與OA 炎癥反應(yīng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，對滑膜炎癥的發(fā)展與軟骨基質(zhì)的破壞具有重要作用，也是OA 治療的潛在靶點。IL-1 是最早出現(xiàn)也是最重要的OA 促炎因子，主要由單核巨噬細胞分泌，亦可由軟骨細胞、滑膜細胞產(chǎn)生。IL-1 有IL-1α 與IL-1β 2 種亞型，其中IL-1β 是IL-1 的主要成分，成熟的IL-1β 是由IL-1 轉(zhuǎn)換酶裂解IL-1β 前體而來，是一種強有力的致痛炎癥因子，在急慢性炎癥中引發(fā)全身性癥狀如發(fā)熱，在局部則引起組織炎癥和破壞性病變。在正常關(guān)節(jié)中IL-1 含量極少，且主要是IL-1β，在OA 中，IL-1、特別是IL-1β 的含量異常升高，影響軟骨細胞的結(jié)構(gòu)和功能，促進其凋亡，打破軟骨基質(zhì)合成與代謝間的平衡，使滑膜出現(xiàn)炎性病變，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞。在關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中，軟骨細胞與滑膜細胞對于保持關(guān)節(jié)功能和結(jié)構(gòu)發(fā)揮著極其重要的作用，IL-1 參與關(guān)節(jié)軟骨與滑膜破壞的起始和進展，IL-1 殺傷線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，軟骨細胞與滑膜細胞的能量供應(yīng)減少，使其活性下降，關(guān)節(jié)的彈性與潤滑功能降低。OA 發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)的功能和疼痛與關(guān)節(jié)滑膜細胞分泌過多的IL-6 并釋放入血有關(guān)。TNF 按其結(jié)構(gòu)不同分為TNF-α 和TNF-β，其中由活化的巨噬細胞、單核細胞和T 細胞產(chǎn)生的為TNF-α。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 是參與OA 炎癥反應(yīng)的重要因素，TNF-α 可刺激滑膜細胞產(chǎn)生前列腺素-E2，增加軟骨下骨的吸收，引起關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原的破壞，在關(guān)節(jié)滑膜炎性病變及軟骨基質(zhì)的降解過程中起重要作用。
中醫(yī)理論認為，OA 多因腎氣虧虛，關(guān)節(jié)失養(yǎng)，局部勞損癖阻，復(fù)受風寒濕邪，經(jīng)絡(luò)不暢，氣血痹阻，關(guān)節(jié)寒凝、痰阻，不通則痛，故治療應(yīng)補益肝腎、活血通絡(luò)、祛風散寒、勝濕止痛。在此基礎(chǔ)上擬定的榮骨定痛膏由山茱萸、杜仲、牛膝、當歸、秦艽、獨活、川烏等四十余味中藥組成，在靖遠縣中醫(yī)院臨床使用取得了較好的療效。本次動物實驗結(jié)果顯示，榮骨定痛膏可明顯擴大病變關(guān)節(jié)的活動范圍，減小滑膜腫脹厚度，從而改善OA 關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)與功能。本次實驗發(fā)現(xiàn)榮骨定痛膏在防治OA 的過程中，可使關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性細胞減少，不同程度地降低IL-1β、IL-6 與TNF-α 的水平，減輕由炎性細胞與上述促炎因子引起的局部與全身反應(yīng)。結(jié)果提示緩解OA 關(guān)節(jié)炎癥、抑制促炎因子IL-1β、IL-6 與TNF-α 的異常升高可能是榮骨定痛膏對OA 起治療作用的機制之一。
由于榮骨定痛膏有多種中藥制成，其膏液有一定的成膜性，在本實驗中當給藥體積在50 μL以下時，在涂抹藥膏后用熱風吹干，可在大鼠關(guān)節(jié)形成附著性很好的極薄藥膜，經(jīng)12 h 觀察藥膜無脫落和舔舐現(xiàn)象。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定每天給藥2 次，既可防止一次給藥造成藥膜太厚引起脫落和大鼠不適舔舐，又可保證每日給藥劑量，提高了實驗結(jié)果的可靠性。
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