談乳果糖對便秘小鼠結腸水通道蛋白4表達的影響的論文
便秘是消化道常見的慢性病癥，隨著飲食結構變化及精神、心理因素的影響，其發(fā)病呈上升趨勢，嚴重影響著人類的身心健康，水代謝紊亂為其主要的發(fā)病環(huán)節(jié)。水通道蛋白(aquaporins，AQP)是特異性轉(zhuǎn)運水的蛋白家族，參與機體水的分泌、吸收及細胞內(nèi)外水平衡的調(diào)節(jié)，已有研究發(fā)現(xiàn)水通道蛋白3、4、8 等存在于結腸，與結腸水吸收密切相關。滲透性瀉藥，通過提高腸腔內(nèi)滲透壓，使糞便含水量增加，緩解便秘癥狀，但其具體作用機制及和水通道蛋白之間的聯(lián)系尚不明確，本研究通過構建小鼠便秘模型，應用免疫組化和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(RT-PCR)方法研究乳果糖對便秘小鼠結腸AQP4 表達情況的影響，探討乳果糖和AQP4 之間的關系，為臨床便秘治療提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組：健康昆明雄性小鼠30 只，體質(zhì)量(20.0±2.0)g，隨機分為陰性對照組、便秘模型組、乳果糖治療組。
1.2 便秘模型制備、成功標準、取材：
�、倌Ｐ椭苽洌簠⒄瘴墨I，便秘組給予50 mg/kg 的復方地芬諾酯灌胃，陰性對照組給予等量的蒸餾水灌胃。灌胃后動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲食進水。便秘模型造模成功后，將模型隨機分為乳果糖治療組和便秘模型組，治療組給予乳果糖(0.6 ml/20 g)灌胃，模型對照組和陰性對照組給予等量的蒸餾水灌胃。
�、� 模型判定標準：觀察陰性對照組與便秘模型組小鼠首粒排便時間、12 h內(nèi)排便粒數(shù)和排便重量數(shù)值比值，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，便秘模型制備成功。
�、廴〔模簩嶒炐∈笠运下热└骨宦樽聿⑻幩�，迅速取升、降結腸組織各1 塊，置于-85 ℃冰箱，供RT-PCR 使用。
1.3 RT-PCR 測定結腸AQP4mRNA 表達：
選用β-肌動蛋白基因為內(nèi)參照引物基因，反應中所用的上游引物為：5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGCC-3′，下游引物為5′-CAGGTCCAGACGACGCAGGATGGC-3′，擴增產(chǎn)物為：270 bp;AQP4(Genbankaccession number U14007)上游引物為：5′-GGGTTGGACCAATCATAGGCGCT-3′(701-723)，下游引物為：5′-GCAGGAAATCTGAGGCCAGTTCTAGG-3 (1030-1005)，擴增產(chǎn)物為：330 bp。cDNA 序列查自基因庫，2 對引物均由上海生物工程技術服務有限公司合成。反應步驟及反應體系見MBIFermentas 公司試劑盒說明，AQP4 反應條件為94 ℃ 30 s，62℃ 30 s，72 ℃30 s，共36 個循環(huán);β-肌動蛋白反應條件為94℃ 20 s，58 ℃ 30 s。72 ℃ 30 s，共35 個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳及半定量分析：取PCR 擴增產(chǎn)物5 μl，置1%瓊脂糖凝膠中，TBE 電泳緩沖液中4 V/cm 電壓電泳60 min，用GDS7500圖像分析系統(tǒng)(英國UVP 公司)進行密度掃描定量，以AQP4基因與β-肌動蛋白比值表示AQP4 mRNA 的相對表達量。
1.4 統(tǒng)計學處理：
計量資料以x±s 表示，所有數(shù)據(jù)均用SPSS17.0 軟件分析。AQP4 表達量的比較采用析因設計的方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 小鼠便秘模型及藥物干預結果：
20 只便秘模型(包括乳果糖治療組用藥前)小鼠與陰性對照組比較，首粒排便時間明顯延長，12 h 內(nèi)排便粒數(shù)、排便質(zhì)量明顯減少(P<0.01)，便秘模型制備成功。乳果糖治療組(用藥后)與陰性對照組以上指標差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)，與便秘模型組比較上述指標差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明用藥后便秘癥狀改善，藥物治療有效。
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