詳談激光針灸對模型大鼠滑膜組織病理改變的影響論文
類風濕性關節(jié)炎( rheumatoid arthritis，RA) 是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其特點是在多個關節(jié)滑膜出現(xiàn)慢性炎癥、軟骨破壞、骨侵蝕，出現(xiàn)關節(jié)腫脹、僵硬、畸形并伴有嚴重疼痛。不受控制的RA 可引起肺癌和心血管系統(tǒng)等多種組織的全身炎癥，導致并發(fā)癥和死亡率增加。雖然RA 的病因和發(fā)病機制還未完全理解，但促炎細胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平升高與疾病的進展和嚴重程度緊密聯(lián)系。多項研究顯示，激光針灸對RA 的治療具有療效好、不良反應少等優(yōu)點，但對其治療機制的研究仍然不甚明確。本研究報道了通過II 型膠原誘導的關節(jié)炎( collagen-induced arthritis，CIA) 大鼠模型，探討激光針灸對其保護作用，為臨床治療提供一定的理論基礎。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗動物4 周齡健康SD 雄性大鼠40只，清潔級，體質(zhì)量( 125 ± 20) g，由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供。
1. 1. 2 試劑與器材連續(xù)半導體激光器( 波長635 nm) 由中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所激光醫(yī)學實驗室研制。Ⅱ型膠原蛋白購自Chondrex公司，弗氏完全佐劑購自Sigma 公司，扶他林購自北京諾華制藥有限公司，酶標儀購自MR 公司。
1. 2 實驗方法
1. 2. 1 造模與分組將所有動物稱重后隨機編號為1-40 號，1-10 號為正常對照組，不做任何處理; 將其余的90 只大鼠采用II 型膠原蛋白進行CIA造模。首先將用0. 1M 的冰醋酸溶解至濃度為2 g / L 的溶液，于4℃ 過夜，加入等體積的弗氏完全佐劑，將兩者在冰浴中混勻乳化制成乳劑，且終濃度為1g /L。每只大鼠注射1ml 該溶液，在背部皮下、尾根部和右后足跖部多點注射，1 周后再次注射0. 5ml加強免疫1 次，建造II 型膠原蛋白誘導的大鼠實驗性關節(jié)炎( CIA) 模型。模型建造后2 周，將造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法分為為模型組( CIA 模型組) 、藥物治療對照組( 即大鼠每天用0. 8 mg /100g 劑量的扶他林乳液灌胃) 、激光針灸治療組( 即每只大鼠每天采用激光照射針灸治療) 3 組。模型組、正常對照組和針灸治療組每天注射生理鹽水。
1. 2. 2 取穴和針灸方法①取穴: 參照“十一五”國家級規(guī)劃教材《實驗針灸學》的定位方法，取大鼠的足三里穴、腎俞穴，腎俞穴在第2 腰椎下兩旁、左右各1 穴，足三里在膝關節(jié)后外側(cè)、腓骨小頭下0. 5 cm 處。在實驗過程中，采用交替治療單側(cè)穴位、左右交叉選取，即在第1 天選擇治療左側(cè)足三里穴和腎俞穴，第2 天則用右側(cè)足三里穴和腎俞穴，第3 天再用左側(cè)進行交替治療。各組在激光針灸治療前對穴位區(qū)局部皮膚均進行剃毛、清潔處理。②激光針灸: 在建造CIA 模型致炎后第3 周，將針灸治療組實驗動物以同樣固定架固定，對足三里穴、腎俞穴進行激光照射。激光輸出功率100 mW，功率密度1. 42 W/cm2，光斑直徑均為0. 3 cm，照射時間10min，每日1 次，共治療15 次。
1. 2. 3 采集標本和指標檢測1) 大鼠關節(jié)評分和足腫脹觀察: 在造模及藥物或針灸治療前后仔細觀察大鼠神志活動及體毛色澤的改變，在給藥或激光針灸前1 d，給藥后或激光針灸后的7 d、14 d，用足趾容積測量儀測量足趾的體積，測量3 次取平均值，根據(jù)四肢的病變程度進行累計積分。2) 采用關節(jié)炎指數(shù)( Arthritis Index，AI) 對關節(jié)紅腫程度進行評定: 關節(jié)無紅腫的為0 分; 個別足趾紅腫發(fā)脹為1 分; 大部分足趾及足底紅腫發(fā)脹為2 分; 踝關節(jié)以下全部腫脹為3 分; 累計踝關節(jié)以上腫脹及不能負重為4 分。AI 為四肢關節(jié)評分之和。3) 提取滑膜組織與評分: 實驗結束后處死所有實驗動物，將大鼠浸泡在100 g /L 的強力消毒水中泡10 min，在超凈工作臺上固定后剪取左踝關節(jié)，切開皮膚后剝離滑膜組織，并用刀片完整切下。用甲醛溶液固定后石蠟包埋、切片，用蘇木精-伊紅染色液( HE) 染色后在顯微鏡下觀察滑膜組織的病理學改變。參照文獻，根據(jù)以下標準對滑膜組織病理變化進行評分。①滑膜細胞增生: 無明顯( 0) 為0 分; 單層密集、腫脹( + ) 為1 分; 增生成2 層( + + ) 為2 分; 增生成3層及以上( + + + ) 為3 分; ②炎性細胞浸潤: 未見或偶見( 0) 為0 分; 稀疏散在少量( + ) 為1 分，較密集中等量( + + ) 為2 分，密集大量( + + + ) 為3分; ③纖維組織增生: 無增生( 0) 為0 分，少量增生( + ) 為1 分，中等量增生( + + ) 為2 分，大量增生( + + + ) 為3 分; ④巨噬細胞增生: 未見( 0) 為0分，稀疏散在少量( + ) 為1 分，中等量( + + ) 為2分，大量( + + + ) 為3 分。
1. 3 統(tǒng)計學方法
采用SPSS 19. 0 統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料以均數(shù)± 標準差( 珋x ± s) 表示，2 組樣本間均數(shù)比較采用t 檢驗，多組樣本間比較采用單因素方差分析，P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2. 1 激光針灸對大鼠身體及關節(jié)腫脹的作用
模型組與空白對照組比較，大鼠的活動有所減少，精神狀況萎靡，后肢關節(jié)部位在造模后第8 天時出現(xiàn)紅腫且日益加重。采用藥物治療和針灸治療后，大鼠后肢的腫脹程度減輕，精神狀態(tài)良好，飲食正常。與模型組比較，給藥或激光針灸后14 d，左后肢的足容積明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義，但均大于空白對照組和給藥前的足容積。經(jīng)過藥物和激光針灸后，與模型組比較，關節(jié)炎指數(shù)AI 明顯降低，且隨著治療時間的延長，腫脹程度逐漸減輕。
2. 2 激光針灸對滑膜組織的影響
組織學檢查結果顯示，與正常組大鼠比較，CIA大鼠的滑膜關節(jié)中出現(xiàn)大量細胞浸潤、滑膜增生、關節(jié)狹窄，形成嚴重的血管。但在藥物治療組和激光針灸組，這些病理變化明顯減少 。與空白對照組比較，模型組大鼠的滑膜增生、炎性細胞浸潤、巨噬細胞增生及纖維組織增生評分和總評分均有統(tǒng)計學意義，顯示造模成功，模型組大鼠的踝關節(jié)滑膜組織的病理學改變明顯。藥物治療和激光針灸組與模型組比較，滑膜增生、炎性細胞浸潤、巨噬細胞增生及纖維組織增生評分與總評分出現(xiàn)不同程度的下降，差異有統(tǒng)計學意義。
3 討論
風濕關節(jié)炎是一種復雜的難治性自身免疫性疾病，特點是關節(jié)疼痛、多發(fā)性關節(jié)炎、關節(jié)破壞，它是由不同致病因素造成的，包括全身和局部炎癥、細胞和體液免疫反應、廣泛的血管生成、基質(zhì)金屬蛋白酶和破骨細胞破壞骨骼和軟骨，但其具體的發(fā)病機制尚不明確。表4 顯示，激光針灸可以抑制滑膜細胞和纖維組織增生，減少炎性細胞浸潤，與對照藥物扶他林比較，療效相當，差異無統(tǒng)計學意義。且激光治療可以緩解足腫脹，降低大鼠四肢的AI 值，但激光針灸治療的作用機制尚待進一步研究，可能是與加快血液循環(huán)有關。
對該病機制的研究，模型的選擇是至關重要的。與經(jīng)典的佐劑誘導關節(jié)炎( agjuvant-inducedarthritis，AIA) 比較，CIA 模型的臨床表現(xiàn)、發(fā)病機制和病例特點以及免疫學指標與人的RA 比較，具有更多的相似性和可比性，是目前國內(nèi)比較認可的用于研究RA 的動物實驗模型。在本研究中，采用CIA 造模2 周后，大鼠的踝關節(jié)出現(xiàn)滑膜增生、纖維組織和巨噬細胞增生、炎性細胞浸潤，與正常組大鼠比較差異有統(tǒng)計學意義。這些病理學表現(xiàn)表明，模型組的.病理學改變與人的RA 接近，說明該模型對于后續(xù)的激光針灸治療結果具有更好的可靠性。
在該病的發(fā)病過程中，4 種病理學改變反映了RA 的發(fā)病程度，滑膜細胞增生是RA 發(fā)病的早期反應，隨著病程的延長，會出現(xiàn)滑膜組織增厚、關節(jié)黏連等病理學改變，該反應是該病發(fā)病過程中的最直接反應。炎性細胞的浸潤反映了免疫反應的激烈程度。該研究結果顯示，藥物組和激光針灸組均有一定程度的炎性細胞浸潤，但與模型組比較有所下降，差異有統(tǒng)計學意義，說明藥物或者激光治療具有一定程度減輕炎性反應的作用。巨噬細胞分為A 型和B 型，是滑膜襯里層的2 種主要細胞，主要來源于血液中單核細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。纖維組織增生則反映了炎癥破壞后纖維組織轉(zhuǎn)移后的修復情況，纖維組織增生越嚴重，說明關節(jié)的軟骨破壞越大。我們的研究結果顯示，藥物治療和激光治療均有一定程度抑制纖維組織增生的作用，且隨著治療時間的延長效果更明顯。
總之，激光針灸治療CIA 大鼠，對大鼠踝關節(jié)的滑膜組織增生和纖維組織增生具有一定的抑制作用，其作用效果和藥物治療效果相當，但其治療作用機制還有待進一步的研究。該治療手段也許可以作為不愿服藥或者藥物治療效果差患者的主要或輔助治療手段。
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