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詳談EZH2對(duì)HSCT6細(xì)胞增殖活化的影響論文
肝纖維化是持續(xù)性肝臟損傷的共同病理改變過(guò)程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)在肝臟中的大量沉積，其持續(xù)發(fā)展可形成肝硬化和肝細(xì)胞癌。肝纖維化的形成機(jī)制目前尚不清楚，研究表明肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)的增殖活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵，抑制HSC的增殖活化成為防治肝纖維化的重點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancerofzestehomolog2，EZH2)在纖維化形成中起重要作用。肝纖維化形成過(guò)程中，MAPK/ERK和PI3K/AKT通路被激活并起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2能夠激活MAPK/ERK 和PI3K/AKT通路，從而引起疾病。本研究擬應(yīng)用EZH2的抑制劑DZNep和小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)抑制EZH2的表達(dá)，考察其對(duì)HSC增殖活化的調(diào)控作用，探究其調(diào)控機(jī)制，以期為肝纖維化的防治提供新的靶點(diǎn)。
1 材料
1.1 細(xì)胞株
大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC睺6購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。
1.2 試劑與儀器
DZNep購(gòu)于Selleckchem公司;TGFβ1購(gòu)于Peprotech公司;噻唑藍(lán)MTT購(gòu)于Sig瞞a公司;DMSO購(gòu)于Sigma公司;胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品;胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司;山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;脂質(zhì)體Lipofectami瞡eTM 2000、Opti睲EM購(gòu)于Invitrogen公司;EZH2、p睧RK、ERK、p睞KT和AKT抗體購(gòu)于CellSignaling公司;α睸MA抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;β瞐ctin抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本);酶標(biāo)儀(bio瞭ekEL)。
2 方法
2.1 HSC睺6細(xì)胞的培養(yǎng)
應(yīng)用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2 及飽和濕度條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70% ～80% 密度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。
2.2 DZNep的應(yīng)用
加入DZNep24h前，將細(xì)胞傳代至6孔培養(yǎng)板，每孔2x105細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分正常組、應(yīng)用TGFβ1刺激的模型組、TGFβ1刺激并加入DZNep的恢復(fù)組。正常組不做任何處理;模型組加入TGFβ1刺激終濃度為10μg· L-1，TGFβ1作用于細(xì)胞的時(shí)間為48h;恢復(fù)組加入TGFβ1刺激終濃度為10μg· L-1，并加入DZNep刺激終濃度為1μmol· L-1，DZNep作用于細(xì)胞的時(shí)間為24h。
2.3 siRNA的合成
根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)針對(duì)EZH2基因的siRNA序列，在GenBank表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用BLAST檢索，并確認(rèn)所設(shè)計(jì)siRNA序列的唯一性，靶向目的基因EZH2的序列設(shè)計(jì)的兩條鏈，正義鏈：5′睪GGCAUCUUUAU睠AAAGAUTT3′;反義鏈：5′睞UCUUUGAUAAAGAUGCCCTT3′。同樣方法構(gòu)建陰性對(duì)照組的兩條鏈，正義鏈：5′睻UCUCCGAACGUGUCACGUTT3′;反義鏈：5′睞CGUGACACGUUCGGAGAATT3′，與任何編碼序列無(wú)同源性，由吉瑪制藥有限公司合成有效siRNA干粉制劑。細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染HSC睺6細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2 培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24h前，傳代至6孔培養(yǎng)板，每孔2x105細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分正常組、模型組、陰性對(duì)照組和EZH2瞫iRNA實(shí)驗(yàn)組。正常組不做任何處理;模型組加入TGFβ1;陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照siR睳A并加入TGFβ1;實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染EZH2瞫iRNA并加入TGFβ1。用Opti睲EM和脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使siRNA終濃度均為100pmol· L-1，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)染6h后，每組加入完全培養(yǎng)基含TGFβ1使刺激終濃度為10μg· L-1，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收獲細(xì)胞。采用熒光倒置顯微鏡觀察各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)并判斷轉(zhuǎn)染效果。
2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
以MTT法檢測(cè)HSC睺6細(xì)胞的增殖，分組同上。將培養(yǎng)的HSC睺6細(xì)胞以10%胎牛血清的DMEM制備成1x108· L-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6h換液，每孔加入完全培養(yǎng)基200μL含TGFβ1使刺激終濃度為10μg·L-1，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72h，然后每孔加05% MTT貯存液20μL繼續(xù)孵育4h，最后棄上清，每孔加入150μL二甲基亞砜溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，置于恒溫震蕩器上震搖10min，應(yīng)用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以空白對(duì)照組作為對(duì)照組，其細(xì)胞存活率為100%，其余各組按：存活率/% =[(各實(shí)驗(yàn)組吸光度值脖鏡孜光度值)/(對(duì)照組吸光度值-本底吸光度值)]x100%。
2.5 Westernblot檢測(cè)EZH2、p睧RK、p睞KT、α睸MA蛋白表達(dá)
細(xì)胞的培養(yǎng)、分組、處理同上。DZNep作用24h或者轉(zhuǎn)染EZH2瞫iRNA48h后，分別提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度。應(yīng)用10% SDS睵AGE凝膠進(jìn)行電泳，在200mA恒定電流下應(yīng)用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，TBST洗膜后，使用5% 牛奶封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，TBST洗膜后，在4℃于一抗(1∶500)中孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或抗兔二抗(1∶10000)室溫中孵育1h，TBST洗膜后，加入ECL發(fā)光劑反應(yīng)20s，電腦顯影成像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次或以上。
2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS130軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以珋x±s表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多__組間比較采用單因素方差分析。
3 結(jié)果
3.1 Westernblot法檢測(cè)應(yīng)用DZNep后HSC睺6細(xì)胞中EZH2、p睧RK、p睞KT和α睸MA蛋白表達(dá)變化 加入TGFβ1的模型組EZH2蛋白表達(dá)水平明顯升高，與正常組相比差異有顯著性(P<001)，加入TGFβ1和DZNep的恢復(fù)組EZH2蛋白表達(dá)水平明顯降低，與模型組相比差異有顯著性(P<001)，見(jiàn)Fig1A;同時(shí)，模型組p睧RK和p睞KT蛋白表達(dá)水平明顯升高，與正常組相比差異有顯著性(P<001)，恢復(fù)組p睧RK和p睞KT蛋白表達(dá)水平明顯降低，與模型組相比差異有顯著性(P<001)，見(jiàn)Fig1B;與此同時(shí)，模型組α睸MA蛋白表達(dá)水平明顯升高，與正常組相比差異有顯著性(P<001)，恢復(fù)組α睸MA蛋白表達(dá)水平明顯降低，與模型組相比差異有顯著性(P<001)，見(jiàn)Fig1C。
3.2 MTT法檢測(cè)HSC睺6增殖活性 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EZH2瞫iRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的HSC睺6細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，EZH2瞫iR睳A實(shí)驗(yàn)組作用12h細(xì)胞抑制率與陰性對(duì)照組、模型組之間差異無(wú)顯著性(P>005);EZH2瞫iRNA實(shí)驗(yàn)組作用24、48、72h細(xì)胞抑制率明顯高于陰性對(duì)照組、模型組(P<005)。同時(shí)，作用24、48、72h時(shí)模型組、陰性對(duì)照組與正常組之間差異有顯著性(P<005)，見(jiàn)Fig2。
3.3 Westernblot法檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后HSC睺6細(xì)胞中EZH2、p睧RK、p睞KT和α睸MA蛋白表達(dá)變化 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EZH2瞫iRNA48h后，EZH2蛋白表達(dá)明顯降低，與陰性對(duì)照組相比差異有顯著性(P<001)，陰性對(duì)照組、模型組與正常組相比差異亦有顯著性(P<001)，見(jiàn)Fig3A;同時(shí)，EZH2瞫iRNA實(shí)驗(yàn)組p睧RK和p睞KT蛋白表達(dá)也明顯降低，與陰性對(duì)照組相比差異有顯著性(P<001)，陰性對(duì)照組、模型組與正常組相比差異亦有顯著性(P<001)，見(jiàn)Fig3B;與此同時(shí)，EZH2瞫iRNA實(shí)驗(yàn)組α睸MA蛋白表達(dá)也明顯降低，與陰性對(duì)照組相比差異有顯著性(P<001)，陰性對(duì)照組、模型組與正常組相比差異亦有顯著性(P<001)，見(jiàn)Fig3C。
4 討論
HSC的增殖活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制HSC的增殖活化成為預(yù)防和治療肝纖維化的重要手段之一。近些年研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)(包括DNA甲基化、microRNA和組蛋白修飾等)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。組蛋白修飾是指在組蛋白相關(guān)酶的作用下，組蛋白發(fā)生乙�；�、磷酸化、甲基化和泛素化等修飾的過(guò)程。組蛋白的甲基化修飾是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的，組蛋白的甲基化可發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上，最終可導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄沉默或轉(zhuǎn)錄激活。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白的甲基化修飾與HSC的狀態(tài)及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。EZH2是一個(gè)重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)特異性甲基化基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3賴氨酸27，廣泛參與了基因的轉(zhuǎn)錄沉默。在癌癥的發(fā)生發(fā)展中，EZH2被認(rèn)為是一個(gè)促癌基因，在子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤中高表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在肝纖維化形成中扮演重要角色，但是其具體機(jī)制尚不清楚。
有文獻(xiàn)報(bào)道，在生長(zhǎng)因子TGFβ1等的刺激下，MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路被激活，進(jìn)而影響到大鼠肝星狀細(xì)胞HSC睺6的增殖活化。有研究發(fā)現(xiàn)，EZH2能夠激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路從而引起疾病的發(fā)生。那么EZH2能否影響TGFβ1誘導(dǎo)的HSC的增殖活化，EZH2通過(guò)何種機(jī)制影響其增殖活化，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。在該項(xiàng)研究中，應(yīng)用TGFβ1誘導(dǎo)HSC增殖活化，同時(shí)應(yīng)用EZH2的抑制劑DZNep和siRNA技術(shù)，抑制HSC睺6中EZH2的表達(dá)，觀察EZH2表達(dá)下調(diào)后對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的HSC增殖活化的影響，及其對(duì)MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。應(yīng)用EZH2的小干擾RNA后，與陰性對(duì)照組比較，EZH2瞫iRNA實(shí)驗(yàn)組EZH2蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。MTT法是評(píng)估細(xì)胞增殖的一種有效方法，MTT的結(jié)果表明，通過(guò)siRNA沉默EZH2的表達(dá)可明顯抑制TGFβ1誘導(dǎo)的HSC睺6細(xì)胞的增殖。α睸MA是HSC活化的特征性標(biāo)志，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，應(yīng)用抑制劑DZNep后，可明顯降低α睸MA蛋白的表達(dá);靶向干擾HSC睺6細(xì)胞中EZH2的表達(dá)，可明顯降低α睸MA蛋白的表達(dá)。表明抑制EZH2的表達(dá)能影響TGFβ1誘導(dǎo)的HSC的增殖活化。結(jié)果進(jìn)一步表明，應(yīng)用TGFβ1刺激HSC睺6細(xì)胞可明顯升高EZH2蛋白表達(dá)水平，也可明顯升高p睧RK、p睞KT蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用抑制劑DZNep后可明顯降低EZH2蛋白表達(dá)水平，也可明顯降低p睧RK和p睞KT蛋白表達(dá)水平。靶向干擾HSC睺6細(xì)胞中EZH2基因的表達(dá)，可明顯降低EZH2蛋白表達(dá)水平，也可降低p睧RK和p睞KT蛋白表達(dá)水平。表明抑制EZH2的表達(dá)能影響TGFβ1誘導(dǎo)的HSC中MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。抑制EZH2的表達(dá)能影響MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，是影響TGFβ1誘導(dǎo)的HSC增殖活化的機(jī)制。
綜上，抑制HSC睺6細(xì)胞中EZH2基因的表達(dá)，能影響TGFβ1誘導(dǎo)的HSC 中MAPK/ERK 和PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，從而抑制HSC的增殖活化。本研究從細(xì)胞分子水平闡明EZH2對(duì)HSC的增殖活化的調(diào)控作用及其可能的潛在調(diào)控機(jī)制。揭示了EZH2在肝纖維化發(fā)展中的重要作用，可能成為防治肝纖維化的潛在新靶點(diǎn)，還需要通過(guò)其它實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。肝纖維化的形成過(guò)程非常復(fù)雜，EZH2如何調(diào)控基因的沉默，尚需進(jìn)一步深入研究。
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