討論補(bǔ)陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠血管新生的影響論文
腦缺血后由于腦組織缺血、缺氧引起缺血半暗區(qū)神經(jīng)元變性、壞死, 而導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損, 因此, 盡快恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)對缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)至關(guān)重要, 而缺血半暗區(qū)血流的恢復(fù)有賴于側(cè)支循環(huán)的建立。血管新生是改善腦組織血流供應(yīng)的一種有效方法, 對中風(fēng)患者的預(yù)后十分關(guān)鍵, 是近年來中風(fēng)研究的熱點(diǎn)之一。補(bǔ)陽還五湯是中醫(yī)治療缺血性腦損傷的有效經(jīng)典方劑, 前期研究表明, 補(bǔ)陽還五湯能顯著提高局灶性腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能,增強(qiáng)腦缺血后血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其受體Flk1的表達(dá), 那么補(bǔ)陽還五湯是否可以促進(jìn)血管新生進(jìn)而抗腦缺血損傷? 本研究通過免疫組織化學(xué)方法觀察腦缺血后血管性血友病因子(vonwillebrandfactor, vWF)的表達(dá), 探討腦缺血是否可以誘發(fā)缺血周圍區(qū)的血管新生, 以及補(bǔ)陽還五湯是否可以促進(jìn)腦缺血大鼠缺血區(qū)血管新生, 為腦缺血后循環(huán)重建和功能恢復(fù)提供一個新的思路和方法。
1 材料與方法
1.1 動物
清潔級SD大鼠100 只, 體重250 ～ 300 g, 雌雄各半, 購于上海實驗動物中心。
1.2 藥物
補(bǔ)陽還五湯處方來源于清· 王清任《醫(yī)林改錯》, 按原方組成:黃芪120 g、赤芍10 g、川芎10 g、當(dāng)歸尾10 g、地龍(研末)10 g、紅花10 g、桃仁10 g,中藥飲片購自湖南省中醫(yī)研究院, 為同一批藥材, 經(jīng)鑒定符合2005年《中國藥典》的規(guī)定。補(bǔ)陽還五湯傳統(tǒng)湯劑制備:傳統(tǒng)飲片先用清水浸泡30 min, 第一煎加藥材5倍體積水, 煎汁30 min, 二煎5倍體積水, 煎汁30 min, 兩煎混合, 每毫克含生藥1.5 g, 置于4℃下冷藏備用。
1.3 試劑
vWF單克隆抗體、羅丹明紅(rhodaminered)、異硫氰酸熒光黃(FITC)均購自美國Sigma公司;BrdU單克隆抗體購自美國Chemico公司;重組人血管內(nèi)皮抑制素(endostatin, ED)購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院;SABC試劑盒、AEC顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TTC(2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchoride)、PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L, Ph值7.2 ～ 7.4)均購自武漢博士德生物工程有限公司;水合氯醛、雙氧水均購自北京鼎國生物工程有限公司。
1.4 儀器
英國Thermo公司E60冰凍切片機(jī);日本Olympus公司BX51 光學(xué)顯微鏡及Image-ProPlus5.1(IPP5.1)圖像分析系統(tǒng);上海玻璃儀器一廠自動雙重純水蒸餾器;杭州藍(lán)天化驗儀器廠ZD-600電熱恒溫水浴箱;上海臺之衡電子衡器有限公司FA型電子天平。
1.5 動物分組與給藥方法
90只大鼠造模成功后隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)陽還五湯組、ED組和補(bǔ)陽還五湯+ED組, 另設(shè)正常對照組、假手術(shù)組各5只, 假手術(shù)組只打開頸部皮膚,暴露頸部血管后不做其它任何處理即縫合。造模成功動物術(shù)后分別存活1、7、14天和28天后處死, 每組每個時間點(diǎn)各5只。補(bǔ)陽還五湯組動物于術(shù)后蘇醒2 h后起按4 mL/kg, 灌服補(bǔ)陽還五湯藥液, 每日1次;ED組動物于術(shù)后按2.5 mg/kg腹腔注射ED,前3天每天1次, 之后每周2次;補(bǔ)陽還五湯加ED組動物同時進(jìn)行上述兩組動物的操作;上述3組按50 mg/kg腹腔注射5-嗅脫氧尿嘧啶核苷進(jìn)行累積標(biāo)記, 前3天每天1 次, 之后每周2次, 動物若死亡則隨機(jī)補(bǔ)充。其他各組動物均給予等體積無菌蒸餾水, 自由飲食、活動。
1.6 動物造模
采用文獻(xiàn)改良的大腦中動脈線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型, 10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉, 固定后頸部正中消毒, 然后做一長約2.5 ～ 3.0 cm的切口, 鈍性分離出右側(cè)頸總動脈, 在其遠(yuǎn)心端分叉處分離出頸內(nèi)動脈和頸外動脈, 結(jié)扎頸總動脈和靠近氣管的頸外動脈, 然后在頸總動脈分叉處近心端作一小切口, 將一段一端鈍圓的4-0尼龍線由頸總動脈插入至頸內(nèi)動脈, 感覺到有輕微阻力為止, 大約進(jìn)入17.0 ±0.5 mm, 然后結(jié)扎固定,縫合切口, 在切口及周圍涂抹抗生素。假手術(shù)組僅切開皮膚, 分離右側(cè)頸總動脈后即縫合。正常組不做任何特殊處理。手術(shù)過程中室溫保持在20 ～30℃并使用加熱墊或白熾燈照射。術(shù)后將動物放入清潔的飼養(yǎng)盒中, 若死亡則隨機(jī)補(bǔ)充造模。
1.7 成功模型標(biāo)準(zhǔn)
行為學(xué)改變表現(xiàn)為動物蘇醒后提尾時左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲;同側(cè)Horner征(頸交感神經(jīng)麻痹綜合征:瞳孔縮小、眼瞼下垂及眼裂狹小、眼球內(nèi)陷和患側(cè)額部無汗);爬行時向左劃圈;站立時左側(cè)傾倒。TTC染色后梗死區(qū)域呈白色, 位置在皮層下, 大腦的一側(cè), 對側(cè)大腦半球正常腦組織則被染成紅色。
1.8 神經(jīng)功能評分
待清醒2 h后按文獻(xiàn)的五級評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分, 0級:行為無明顯變化(0 分);1 級:左前肢屈曲, 左后肢伸展(1 分);2級:有左側(cè)追尾現(xiàn)象(2分);3級:行走困難, 搖擺不定(3分);4級:無自發(fā)性活動, 有意識障礙(4分)。將第1、2、3級(1 ～ 3分)大鼠確定為成功模型分入各組。
1.9 標(biāo)本處理
將待取材大鼠腹腔注射水合氯醛(4 mL/kg)麻醉固定, 打開胸腔并充分暴露心臟, 將注射用6號針頭由心尖插入至主動脈并固定好針頭, 剪開右心耳,快速滴入0.01 mol/LPBS(100 mL), 同時夾閉腹主動脈, 待無血污流出或前爪和肺部顏色變白后改滴4℃的4%多聚甲醛(大約200 mL)固定, 先快后慢,開顱取腦并去除小腦只保留大腦, 放入4%多聚甲醛中4℃下固定24 h, 然后依次放入20%和30%蔗糖溶液中沉底48 h進(jìn)行梯度脫水, OTC包埋, 冰凍切片, 取視交叉向前5 mm向后8 mm大腦中動脈供血區(qū)域即海馬部位做冠狀切片, 25 μm/片, 每隔2片切3 片取作標(biāo)本, 分別用于免疫組織化學(xué)BrdU、vWF酶學(xué)染色及BrdU/vWF熒光雙標(biāo)染色。
1.10 TTC染色
參照文獻(xiàn)將合格大鼠麻醉, 從背面剪下頭部并取出大腦, 用0.01 PBS沖洗后立刻放入-34℃冰箱內(nèi)快速冷凍30 min, 自腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處和漏斗柄與尾極之間, 作冠狀切片, 每隔2 mm切1片, 一般切5 ～ 6片, 置于2%TTC中, 37℃避光水浴20 ～ 30 min, 并做正常大鼠大腦TTC染色以對比觀察缺血程度。
1.11 單標(biāo)酶學(xué)免疫組織化學(xué)法
OTC包埋, 冰凍切片;切片放入3%H2 O2 去離子水中浸10 min, 滅活源性過氧化物酶活性;0.01mmol/LPBS洗5 min×3;滴加10 μL正常山羊血清室溫下封閉30 min;加入vWF抗體(1∶100)10 μL,37℃水浴3 h或4℃過夜;0.01 mol/LPBS洗5 min×3;加入通用生物素化二抗10 μL, 37℃水浴30min;0.01 mol/LPBS洗5 min×3;加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素10 μL, 37℃水浴30 min;0.01 mol/LPBS洗5 min×3;滴加AEC顯色劑10 min;0.01mol/LPBS洗3 min×2;貼片并用水溶性封片劑封片;同時用0.01 mol/LPBS代替一抗作空白對照以檢查免疫反應(yīng)的特異性并排除假陽性結(jié)果。
1.12 雙標(biāo)熒光免疫組織化學(xué)法
3%H2O2 去離子水中浸10 min;PBS洗5 min×3;2 mol/LHCl37℃浸15 min;PBS洗5 min×3;5%山羊血清室溫下封閉30 min, 吸去勿洗;加入BrdU單克隆抗體(1∶100)10 μL, 37℃水浴3 h或4℃過夜;PBS洗5 min×3;羅丹明(發(fā)射光波長570 ～ 590nm, 紅光)染色, 37℃水浴30 min;PBS洗5 min×3;5%山羊血清室溫下封閉30 min, 吸去勿洗;vWF(1∶100)10 μL37℃水浴3 h或4℃過夜;PBS洗5min×3;FITC(發(fā)射光波長520 ～ 530 nm, 黃綠色光)染色, 37℃水浴30 min;PBS洗5 min×3;貼片待自然風(fēng)干后用甘油封片。
1.13 陽性細(xì)胞與新生血管計數(shù)
AEC顯色為紅色, 單標(biāo)免疫組織化學(xué)時, 紅色為陽性表達(dá)。FITC標(biāo)記在皮層波長呈綠色, rhodamine標(biāo)記在皮層波長呈紅色, 然后用軟件進(jìn)行重疊, 染色為黃色為雙標(biāo)陽性細(xì)胞。每只動物取海馬部位不同斷面切片5 張, 置于10 ×20倍光鏡下, 每張切片隨機(jī)選取5個視野, 用OlympusImage-ProPlus5.1圖象處理系統(tǒng)自動計數(shù)陽性細(xì)胞和新生血管數(shù), 計算其平均值。每張切片選擇3個_血管最多的區(qū)域, 在10 ×20倍光鏡下進(jìn)行計數(shù)。
1.14 統(tǒng)計學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)以x±s表示, 應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析, 組間比較用單因素方差分析, P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 補(bǔ)陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響
正常組和蘇醒2 h后假手術(shù)組動物未見神經(jīng)功能缺損, 造模后各手術(shù)組動物都存在有明顯神經(jīng)功能缺損, 提示造模成功, 但神經(jīng)功能評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著存活時間延長, 各組動物積分逐步減少。用藥7天和14天, 補(bǔ)陽還五湯組降低神經(jīng)功能積分作用與其它用藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。補(bǔ)陽還五湯+ED組降低積分作用強(qiáng)于模型組和ED組(P<0.05), 但較補(bǔ)陽還五湯組作用弱P<0.05。
2.2 動物情況
造模后模型組、補(bǔ)陽還五湯組和ED組各死亡5只, 另取同樣情況大鼠補(bǔ)足數(shù)目。術(shù)后2 h模型組神經(jīng)功能評分1級2只, 2級10只, 3級6只, 4級2只;補(bǔ)陽還五湯組1級4只, 2級10只, 3級6只, 4級0只;ED組1級2只, 2級11只, 3級5只, 4級2只, 假手術(shù)組無明顯神經(jīng)功能缺損。取出造模成功7天后的大鼠腦組織, 與正常大腦相比, 肉眼可以清晰地觀察到右側(cè)大腦半球明顯腫脹, 梗死區(qū)域面積與體積均大于對側(cè)半球, 顏色蒼白, 可見白色的梗死灶, 梗死區(qū)域為松果體上上下5 mm～視交叉上上下6 mm。右側(cè)頸靜脈注射兌入生理鹽水的2%伊萬斯。
2.3 TTC染色情況
隨機(jī)各組取5只動物進(jìn)行TTC染色, 正常組織染成紅色, 梗死區(qū)域顏色蒼白。正常組和假手術(shù)組均未見梗死灶, 其它各組均見皮層、皮層下及海馬CA1區(qū)白色片狀梗死區(qū)域。1天時各組梗死區(qū)域均較大, 且差異無顯著性(P>0.05)。隨著時間的推移, 各組白色梗死區(qū)域面積均逐漸減小, ED組梗死面積大于同期各組(P<0.05), 28天時ED組與各組差異最大(P<0.05);7、14天和28天時補(bǔ)陽還五湯組梗死面積明顯小于其它各組(P<0.05);而補(bǔ)陽還五湯+ED組梗死面積小于模型組和ED組(P<0.05), p="">0.05;缺血1天與7天大腦TTC染色比較 上為缺血1 天,下為缺血7 天。
2.4 補(bǔ)陽還五湯對腦缺血后新生細(xì)胞的影響
免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示的BrdU陽性細(xì)胞內(nèi)呈棕紅色深染, 為細(xì)胞核染色, 形態(tài)多樣, 胞核多為實性, 呈圓形、橢圓形、梭形或不規(guī)則形, 甚至有部分融合成團(tuán)。正常組可見少量BrdU陽性細(xì)胞散在分布于各腦區(qū), 但數(shù)量少且排列比較稀疏。腦缺血后即可見BrdU陽性細(xì)胞增加, 主要集中在梗死周圍區(qū)、室旁區(qū)、皮質(zhì)或脈絡(luò)膜, 排列不規(guī)整, 胞體形狀不一,7天時達(dá)高峰, 而且排列緊密, 然后逐漸下降, 14天仍高于正常。ED組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于同期模型組和其他組(P<0.05);補(bǔ)陽還五湯組細(xì)胞增殖規(guī)律與模型組一致, 7天和14天時補(bǔ)陽還五湯組在陽性細(xì)胞數(shù)目上與同期各組比較具有顯著性差異(P<0.05);7天時補(bǔ)陽還五湯+ED組陽性細(xì)胞數(shù)量多于模型組和ED組(P<0.05), 但少于補(bǔ)陽還五湯組(P<0.05)。
3 討論
腦缺血后, 受損的腦細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性介質(zhì), 釋放自由基等細(xì)胞毒性物質(zhì), 誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附, 介導(dǎo)炎癥瀑布反應(yīng), 阻塞微血管, 釋放大量谷氨酸, 并激活其受體, 導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性損傷, 致使大量花生四烯酸釋放, 使細(xì)胞腫脹, 引起腦血管痙攣, 血管通脫性增加, 產(chǎn)生血管源性腦水腫[ 11]等。血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上通過血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走、芽生, 血管分裂、分支而形成新的毛細(xì)血管網(wǎng), 使其功能與局部需要相適應(yīng)的生物學(xué)過程。主要包括三個連續(xù)環(huán)節(jié):
�、� 內(nèi)皮細(xì)胞激活, 通透性增加, 基底膜溶解, 細(xì)胞外基質(zhì)降解、重塑;
⑵ 內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移;
�、� 管壁和管腔的形成、再塑, 新生血管網(wǎng)絡(luò)形成。同時, 血管新生又是一個復(fù)雜的多步過程, 并受到多種血管生長因子、細(xì)胞因子及其抑制因子之間的調(diào)控, 反映了正、負(fù)血管新生調(diào)節(jié)物的消長平衡。
補(bǔ)陽還五湯是臨床治療缺血性腦中風(fēng)的常用方劑, 本研究初步證實:補(bǔ)陽還五湯可促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)血管新生, 并可部分拮抗ED阻斷的血管新生。研究結(jié)果顯示ED可有效抑制BrdU及vWF的表達(dá), 其作用機(jī)理可能是ED與VEGF競爭細(xì)胞表面的硫酸肝素粘蛋白類受體, 并抑制VEGF2型受體磷酸化, 進(jìn)而阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂生長因子的信號傳導(dǎo), 提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向遷移而抑制血管新生, 或通過信號通路抑制對方的作用, 如整合素樣金屬otifs,ADAMTS1)是已知的血管新生抑制因子, 但在視網(wǎng)膜血管生成過程中, VEGF通過蛋白激酶C通路顯著地誘導(dǎo)ADAMTS1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá), 說明兩者可能存在一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制 。而BrdU標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞是新生血管的`基礎(chǔ), 補(bǔ)陽還五湯+ED組促細(xì)胞增殖的作用較單獨(dú)補(bǔ)陽還五湯組要弱,但強(qiáng)于模型組, 也就是說補(bǔ)陽還五湯能部分拮抗ED的抑制血管新生的作用, 并且被ED抵消后的剩余的作用仍強(qiáng)于機(jī)體自身的恢復(fù)能力。補(bǔ)陽還五湯促血管新生的作用機(jī)制可能是:
(1)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。補(bǔ)陽還五湯能有效解除ED對血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂生長因子信號傳導(dǎo)的阻斷,降低其對血管內(nèi)皮細(xì)胞定向遷移的促進(jìn)作用, 改善細(xì)胞外環(huán)境, 使內(nèi)皮細(xì)胞在一個相對穩(wěn)定并且干擾較少的環(huán)境下逐步形成新生血管, 說明補(bǔ)陽還五湯不僅有直接保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用, 而且還可以通過改善細(xì)胞外環(huán)境、拮抗血管新生抑制劑(如ED等)的作用來間接保持內(nèi)皮細(xì)胞的完整, 并使其最終形成新的血管。
(2)調(diào)節(jié)血管再生因子:如VEGF、NO__等。VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮生長因子, 它可以促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、增生和轉(zhuǎn)移, 它在血管生成的各個階段均發(fā)揮著重要作用, 是目前公認(rèn)的血管新生中最關(guān)鍵的因子。NO是一種自由基氣體, 參與中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用, 它與O-2結(jié)合可生成過氧亞硝基, 后者可直接或通過分解成許多小分子毒性物質(zhì)損傷細(xì)胞, 并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。郭氏得出補(bǔ)陽還五湯能有效降低大鼠血清及腦組織中NO的含量。其作用機(jī)制可能是補(bǔ)陽還五湯能阻斷NO損傷細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程, 并通過其抗氧自由基作用, 改善線粒體功能, 進(jìn)而改善腦組織的能量代謝, 使NO的合成減少;也可能是通過防止細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷的作用來控制腦組織中NO含量升高, 進(jìn)而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。
(3)促進(jìn)血管出芽。本研究已證實補(bǔ)陽還五湯可以增強(qiáng)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激與趨化作用, 使其增殖、移行和分化, 這也與國內(nèi)其它研究結(jié)果相符合, 又如前述補(bǔ)陽還五湯可以促VEGF表達(dá)增強(qiáng), 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂;降低腦組織NO含量, 起到抗氧自由基、保護(hù)腦組織的作用;并且改變細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì), 促進(jìn)管狀結(jié)構(gòu)的形成, 有利于新血管的出芽與生長, 促進(jìn)新血管的形成以及血管網(wǎng)絡(luò)的建立, 國內(nèi)其它研究也證實補(bǔ)陽還五湯可以通過調(diào)控促血管生成素-1及其受體的表達(dá), 來促進(jìn)腦出血大鼠血腫吸收, 改善腦組織循環(huán), 對血管的重建起到一定的作用。本研究在上述研究成果的基礎(chǔ)上得出補(bǔ)陽還五湯促血管新生的途徑之一便是通過調(diào)控vWF的表達(dá)來實現(xiàn)的。
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