談地黃丸類方對腎陽虛大鼠HPA 軸的影響論文

　　地黃丸類方是指以地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮等為基礎方衍生的一系列用于治療腎虛的復方，最早出現(xiàn)在漢代張仲景的《金匱要略》中，又名腎氣丸，用于治療腎氣不足，氣化不及，小便不利的癥狀，現(xiàn)代多用于治療腎陽虛證。地黃丸類復方種類較多，應用也較為廣泛，尤其以桂附地黃丸、六味地黃丸、知柏地黃丸等應用最多。中醫(yī)治病的原則是辨證施治，現(xiàn)代疾病雖然復雜，但仍存在明顯的證候差異，兩類不同復方異病同治的物質基礎以及內涵有待進一步研究。目前，腎虛本質的研究主要集中在神經內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、自由基、衰老等方面。本研究采用經典腎陽虛建模方法氫化可的松注射液肌注2 周造成大鼠腎陽虛模型，觀察地黃丸類方對腎陽虛大鼠的生存狀態(tài)、血漿環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)及血清皮質酮(CORT)含量以及cAMP/cGMP 水平的影響，比較3 種地黃丸類方對腎陽虛大鼠生存狀態(tài)及下丘腦- 垂體- 腎上腺軸(HPA)的影響，為臨床合理用藥提供依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 藥品及試劑

　　六味地黃丸、知柏地黃丸、桂附地黃丸，均為河南省宛西制藥股份有限公司產品，批號分別為：120309，120301 和120402;氫化可的松注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號：1110211;無菌生理鹽水，貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號：20130621;大鼠血漿cAMP 試劑盒， 批號：DRE68730; 大鼠血漿cGMP 試劑盒， 批號：DRE68735; 大鼠血漿CRH 試劑盒， 批號：DRE69547; 大鼠血漿ACTH 試劑盒， 批號：DRE69548; 大鼠血清CORT 試劑盒， 批號：DRE68355，均為廣州有田生物科技有限公司產品。

　　1.2 儀器

　　LF26-MESJ 分析天平，香港佳立國際有限公司;TC-3K 電子天平，深圳市華恒科技有限公司;歐姆龍體溫計MC-246，歐姆龍(大連)有限公司;RT-2100C 酶標儀，深圳雷杜公司。

　　1.3 動物

　　SD 大鼠，SPF 級，雄性，體質量180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(粵)2008-0020。

　　1.4 分組、模型

　　復制及給藥取SD 大鼠80 只，隨機分為正常組10 只，氫化可的松組70 只。正常組肌肉注射等體積生理鹽水，其余大鼠每天于后肢外側肌肉注射氫化可的松注射液25 mg·kg-1，左右后肢交替注射，連續(xù)注射14 d。造模結束后，將氫化可的松組的70 只大鼠隨機分成7 組(每組10 只)，即模型組，六味地黃丸高、低劑量組(4，1 g·kg-1)，知柏地黃丸高、低劑量組(4，1 g·kg-1)，桂附地黃丸高、低劑量組(4，1 g·kg-1)。灌胃給藥，各藥物組灌胃相應藥物，正常組、模型組給予等體積滅菌蒸餾水，連續(xù)21 d。

　　1.5 一般狀態(tài)

　　觀察實驗期間考察各組大鼠精神狀態(tài)、體質量、肛溫的變化。1.6 血漿cAMP、cGMP、CRH、ACTH 及血清CORT 水平的檢測末次給藥后1 h，腹腔內注射10 %水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血，分裝于無肝素鈉離心管和有肝素鈉離心管中，靜止1~2 h，分離血清、血漿，按照試劑盒說明書檢測大鼠血漿cAMP、cGMP、CRH、ACTH 及血清CORT 含量;計算cAMP/cGMP。

　　1.7 統(tǒng)計學處理

　　方法采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，各組數(shù)據均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD 法。

　　2 結果

　　2.1 對腎陽虛型大鼠生存狀態(tài)的影響與正常組比較，模型組大鼠少動怕冷、大便溏瀉、毛發(fā)無光澤、消瘦萎靡，3 周后狀態(tài)基本無改變。與模型組比較，桂附地黃丸組給藥2 周后多數(shù)大鼠便溏現(xiàn)象好轉，行為活躍，精神狀態(tài)較佳，3 周后基本無便溏現(xiàn)象，動作活躍，毛發(fā)有光澤;六味地黃丸組大鼠在給藥3 周后便溏現(xiàn)象有所好轉，但仍有部分大鼠便溏，大鼠狀態(tài)趨向良好，動作行為活躍;知柏地黃丸組大鼠給藥3 周后除體重略有升高外，其余狀態(tài)變化較小。給藥前除正常組外，其余大鼠采用隨機分組，故各組大鼠體質量相似，差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);與模型組比較，給藥2 周，3 種地黃丸方高、低劑量組均能較快的增加大鼠體質量(P<0.05，P < 0.01);給藥3 周后，大鼠體質量雖有增長(P < 0.05，P < 0.01)，但增長速率明顯降低，最終均未達到正常水平;提示3 種地黃丸方均有糾正大鼠陽虛體質和改善大鼠體質量的作用，且各組無明顯差異。

　　2.2 對大鼠肛溫的影響給藥前除正常組外，其余大鼠采用隨機分組，故各組大鼠肛溫相似，差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);給藥2 周，與模型組比較，桂附地黃丸高劑量組能升高大鼠肛溫，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);給藥3 周后，桂附地黃丸高、低劑量組仍有升高大鼠肛溫的作用，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);六味地黃丸高、低劑量組和知柏地黃丸高、低劑量組仍有升高大鼠肛溫的作用，但作用不明顯，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。提示桂附地黃丸效果可能優(yōu)于六味地黃丸和知柏地黃丸。

　　2.3 對腎陽虛大鼠血漿cAMP、cGMP 水平的影響與正常組比較，各組cAMP 含量均無明顯變化(P >0.05)，但模型組cGMP 含量升高，且cAMP/cGMP 比值下降(P < 0.01);桂附地黃丸高、低劑量組cGMP含量明顯降低、cAMP/ cGMP 比值明顯升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)，提示桂附地黃丸可能具有溫熱、助陽的特性，達到調節(jié)機體陰陽平衡的作用，而六味地黃丸和知柏地黃丸在調節(jié)陰陽方面未表現(xiàn)出顯著的作用。

　　3 討論

　　熟地黃主要活性成分為多糖;山藥主要活性成分為山藥多糖;山茱萸多糖是山茱萸生物學活性物質的重要成分。在3 種地黃丸類方中，六味、桂附、知柏地黃丸均以“三補三瀉”為基礎方，其中，熟地黃為君藥，山藥、山茱萸為臣藥，共同組成全方的“三補”部分，3 種地黃丸類方均以補為主，通過調節(jié)機體免疫達到滋補的功效。

　　中醫(yī)陽虛指陽氣不足或功能衰退的證候，虛寒為陽虛證最典型的癥狀。腎精是個體發(fā)育的基礎，是藏于腎中的精微物質。根據精微物質的陰陽屬性可分為腎陰、腎陽，若陰陽平衡遭到破壞，不能自行恢復時，即形成腎陰虛或腎陽虛的病證。本研究采用氫化可的松肌肉注射14 d 成功復制腎陽虛大鼠模型，造模結束后，氫化可的松組大鼠體質量、肛溫均有顯著降低(P < 0.01)，建模方法可靠。本研究發(fā)現(xiàn)，3種地黃丸類方在體質量變化方面均表現(xiàn)出補益的功效，但對于肛溫的影響，補陽類方效果明顯優(yōu)于補陰類方，其作用強度表現(xiàn)為桂附地黃丸>六味地黃丸>知柏地黃丸。

　　國內外對環(huán)核苷酸與中醫(yī)陰陽的關系做了大量的研究報道，美國生物學家Goldberg 在70 年代初曾提出細胞功能調節(jié)的陰陽學說，認為cAMP 與cGMP 通常呈拮抗性共同參與細胞反應的調節(jié)。國內研究顯示，cAMP 和cGMP 在不同疾病虛證患者中的變化規(guī)律，得出相同結論：凡中醫(yī)辨證陽虛者，cAMP/cGMP 比值明顯降低;而各類疾病辨證為陰虛者則表現(xiàn)為cAMP 含量升高，伴以無明顯降低的cAMP/cGMP 比值。測定血漿cAMP、cGMP 含量及其比值可以作為幫助判斷陰虛、陽虛的一個客觀指標，從而可能對臨床中病情較為復雜病例的辨證有一定參考價值。研究發(fā)現(xiàn)，腎陽虛模型大鼠血漿中的cAMP/cGMP 比值降低。本實驗結果顯示，桂附地黃丸可顯著升高cAMP/cGMP 比值，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)。桂附地黃丸可能具有溫熱、助陽的特性，達到調節(jié)機體陰陽平衡的作用。而六味、知柏地黃丸在調節(jié)陰陽方面未表現(xiàn)出顯著的作用。

　　采用氫化可的松可使模型組大鼠垂體前葉的促腎上腺皮質激素(ACTH)的釋放受到抑制，形成下丘腦- 垂體- 腎上腺軸(HPA 軸)功能抑制的狀態(tài)，其癥狀表現(xiàn)符合中醫(yī)腎陽虛證的臨床表現(xiàn)。本研究采用糖皮質激素注射，造成模型組大鼠HPA 軸功能顯著抑制，表明腎陽虛證與神經內分泌系統(tǒng)存在密切聯(lián)系。桂附地黃丸和六味地黃丸均可顯著恢復大鼠HPA 軸功能，其中，桂附地黃丸效果明顯優(yōu)于六味地黃丸，知柏地黃丸無明顯改善HPA 軸抑制狀態(tài)的作用。

　　本研究對地黃丸類方的藥理作用進行研究，主要考察地黃丸類方對腎陽虛大鼠治療作用的異同。同時發(fā)現(xiàn)證型相反的地黃丸類方對腎陽虛大鼠神經內分泌免疫網絡的影響既存在差異，亦存在相似的地方。

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