大黃素甲醚對(duì)抑郁大鼠海馬ERK、cAMP、CaMK 的影響論文
目前抗抑郁藥在治療抑郁癥時(shí)都有幾個(gè)共性，如起效遲緩、需長(zhǎng)期服藥，只有約60%～70%的患者有效等。大黃素甲醚有抗抑郁作用，與抑郁相關(guān)的信號(hào)通路的調(diào)節(jié)是抗抑郁藥長(zhǎng)期作用的一個(gè)中心環(huán)節(jié)，本研究在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激(CUMS)大鼠抑郁模型，以海馬細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)，環(huán)磷腺苷(cAMP)，鈣離子依賴的蛋白激酶(CaMK)信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討大黃素甲醚的抗抑郁作用機(jī)制。
1材料和方法
1.1試驗(yàn)
藥物大黃素甲醚(標(biāo)準(zhǔn)品)由成都普思生物科技有限公司提供，純度:95%，百優(yōu)解，禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào)J20120001，臨用前用蒸餾水配制為混懸液。
1.2動(dòng)物雄性SD大鼠，體重180g～220g，購(gòu)于簡(jiǎn)陽達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，合格證號(hào):SCXK(川)2014-189。
1.3試劑
ERK試劑盒，貨號(hào):20140630LC，cAMP試劑盒，貨號(hào):20140622SA，CaMK試劑盒，貨號(hào):20140630LK，均由Abcam公司生產(chǎn)，北京永輝生物科技有限公司進(jìn)口分裝。
1.4儀器
酶標(biāo)儀:型號(hào):MultlskanMk3，賽默飛世爾儀器有限公司生產(chǎn)，大鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱100cm×100cm木箱(自制)，底部等分為25個(gè)20cm×20cm小格。轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2016，德國(guó));數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)等;圖像分析軟件MoticImagesAdvanced。
1.5方法參照文獻(xiàn)
稍作改進(jìn)，將60只SPF雄性大鼠，隨機(jī)分成2組:空白組10只，模型組50只。模型組的大鼠造模2周后，按體重和開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)分為模型組、百優(yōu)解組、大黃素甲醚高中低劑量組。刺激因子包括14種:水平震蕩(30次/min，1min/d)、電刺激(0.1mA，1min/次×10次)、噪音(10dB，1min/次×10次)、通宵照明(日光燈24h)、冰水游泳(4℃，5min)、禁食(24h)、鼠籠傾斜(45°12h)、熱刺激(45℃烘箱，5min)、潮濕墊料(將200ml水加到有墊料的籠底)、禁水(24h)、禁食禁水(24h)、異物放置(100g沙子24h)、明暗循環(huán)(4次，30min/次)、異味刺激(0.6%冰醋酸24h)。每日安排1種刺激，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，共造模6周。造模第3周開始給藥至第6周結(jié)束，共給藥4周，空白組及模型組給予等容積蒸餾水。
1.5.1開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)將大鼠放入自制大鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱的中心位置，適應(yīng)2min后，觀察隨后4min內(nèi)大鼠的爬行格子數(shù)、站立次數(shù)。徹底清潔實(shí)驗(yàn)箱之后再進(jìn)行下一只大鼠的觀察。為避免每周進(jìn)行而動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性，開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分別在大鼠分組前、造模2周及6周后進(jìn)行，共3次。
1.5.2糖水消耗實(shí)驗(yàn)造模前一周對(duì)大鼠進(jìn)行2次1%糖水偏好訓(xùn)練，然后在造模前1天和造模后每周固定時(shí)間測(cè)定1次，共計(jì)7次。糖水偏好訓(xùn)練和測(cè)試均于大鼠禁食禁水24h后進(jìn)行，時(shí)間為下午14:00～15:00。以大鼠的糖水偏愛百分比(糖水消耗量/總液體消耗量×100%)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。
1.5.3大鼠海馬ERK、cAMP、CaMK的蛋白含量測(cè)定取海馬，-80℃冰箱保存，第二天測(cè)指標(biāo)。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定海馬ERK、cAMP、CaMK蛋白含量，本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠ERK、cAMP、CaMK水平。用純化的大鼠ERK、cAMP、CaMK抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加ERK、cAMP、CaMK與HRP標(biāo)記的ERK、cAMP、CaMK抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ERK、cAMP、CaMK呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠ERK、cAMP、CaMK濃度。
1.5.4大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)的觀察參照大鼠腦組織定位圖譜取大鼠腦組織，10%中性甲醛固定，經(jīng)過不同濃度乙醇梯度脫水、二甲苯透明，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，常規(guī)光鏡觀察，顯微鏡照相。
2結(jié)果
2.1大黃素甲醚對(duì)CUMS模型大鼠爬行格子數(shù)和站立次數(shù)的影響__結(jié)果表明，在CUMS造模程序連續(xù)實(shí)施的6周，與空白組比較，模型組的大鼠在開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的.爬行格子數(shù)和站立次數(shù)表現(xiàn)出低下，提示該模型的有效性和持續(xù)性。與模型組比較，大黃素甲醚能對(duì)抗該程序?qū)?dòng)物運(yùn)動(dòng)能力和探究能力的抑制作用。
2.2大黃素甲醚對(duì)CUMS模型大鼠糖水消耗量的影響結(jié)果表明，CUMS程序?qū)嵤┖�，模型組與空白組比較，大鼠糖水消耗量顯著減少;CUMS程序?qū)嵤?周，模型組的大鼠糖水消耗量仍然顯著低于空白組。提示CUMS程序的應(yīng)用能引起動(dòng)物的快感缺乏，該模型的有效性和持續(xù)性。大黃素甲醚給藥1周(造模第3周)對(duì)模型組的大鼠糖水消耗量無顯著影響;連續(xù)給藥2周(造模第4周)，大黃素甲醚能提高模型大鼠的糖水消耗量;連續(xù)給藥4周(造模第6周)，大黃素甲醚能提高模型大鼠的糖水消耗量，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.3大黃素甲醚對(duì)CUMS模型大鼠海馬細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，鈣離子依賴的蛋白激酶，環(huán)磷腺苷蛋白含量的影響與空白組比較，模型組海馬海馬ERK、cAMP的蛋白含量減少，CaMK的蛋白含量增加，與模型組比較，大黃素甲醚能增加海馬ERK、cAMP的蛋白含量，減少CaMK的蛋白含量。
2.4大黃素甲醚對(duì)CUMS模型大鼠腦組織病理形態(tài)的影響與空白組比較，模型組灰質(zhì)區(qū)細(xì)胞層次欠清楚，神經(jīng)細(xì)胞(錐體細(xì)胞)似減少，排列較亂、密集，部分退變的神經(jīng)元為紫藍(lán)色小體(密集嗜堿性深染不規(guī)則梭形結(jié)構(gòu))，細(xì)胞漿、核不清，膠質(zhì)細(xì)胞增生;白質(zhì)區(qū)灶性致密紅染(可能為神經(jīng)纖維變性所致)，可見退行性病變。與模型組比較，大黃素甲醚腦灰質(zhì)、白質(zhì)區(qū)組織結(jié)構(gòu)正常，灰質(zhì)區(qū)細(xì)胞層次可見細(xì)胞數(shù)量基本正常，退變的神經(jīng)元嗜堿性深染不規(guī)則梭形結(jié)構(gòu)可見，數(shù)量較模型組少，皮質(zhì)表層水腫，組織裂開，細(xì)胞間可見棕色細(xì)顆粒物，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多，病變總體較輕。
3討論
研究表明，與抑郁相關(guān)的信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)是抗抑郁藥長(zhǎng)期作用的一個(gè)中心環(huán)節(jié)。而環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein，CREB)是這些相關(guān)信號(hào)通路中的一個(gè)交匯點(diǎn)，對(duì)胞內(nèi)的生化過程有著重要的影響。新的研究提示，CREB相關(guān)信號(hào)通路的激活，可能在抑郁癥發(fā)病及抗抑郁藥作用機(jī)制中起重要作用。多種不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以CREB磷酸化，CREB可被cAMP系統(tǒng)中的PKA磷酸化，被CaMK和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中的核糖體S6激酶磷酸化。這3種CREB的磷酸化方式是目前研究認(rèn)為與抑郁癥和抗抑郁藥作用相關(guān)的3條通路，而CREB正是上述通路的交匯點(diǎn)。
ERK為MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)家族的一員，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，ERK與記憶和突觸可塑性關(guān)系密切，ERK通過磷酸化CREB而調(diào)節(jié)CREB的活性，參與了記憶和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的調(diào)控。腦內(nèi)ERK1/2活性和表達(dá)的改變引起抑郁癥的發(fā)生。結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激引起大鼠海馬ERK蛋白含量降低，ERK活性降低削弱其對(duì)CREB的調(diào)節(jié)能力，引起CREB磷酸化水平降低，進(jìn)而損害了長(zhǎng)時(shí)記憶和LTP的形成。但具體機(jī)制需要更詳盡的研究加以闡明。
CaMK信號(hào)通路在抑郁癥發(fā)病及抗抑郁治療途徑中具有重要作用。另有研究證實(shí)，CaMK在鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著軸心的作用，是CaMK通路上關(guān)鍵因子，其蛋白表達(dá)變化反映了CaMK通路的活性，CREB磷酸化→調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄→生物效應(yīng)�？赡芡ㄟ^抑制CaMK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性而發(fā)揮其抗抑郁效應(yīng)。cAMP通路，在情緒調(diào)節(jié)中起重要作用，是研究得最早、最為深入的抗抑郁藥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，許多胞內(nèi)的生化反應(yīng)機(jī)制都是其啟動(dòng)或參與的。多數(shù)抗抑郁藥可以引起腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)濃度增加，5-HT和NE與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，激活cAMP通路。
本研究采用采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定海馬ERK、cAMP、CaMK蛋白含量，結(jié)果顯示，CUMS造模程序可使大鼠海馬ERK、cAMP的蛋白含量減少，CaMK的蛋白含量增加，進(jìn)一步證實(shí)了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的作用，大黃素甲醚能增加CUMS大鼠海馬ERK、cAMP的蛋白含量，減少CaMK的蛋白含量。綜上所述，大黃素甲醚具有抗抑郁作用，其機(jī)制通過影響海馬ERK、cAMP、CaMK的蛋白含量，改善受損傷的腦組織，可能通過調(diào)節(jié)與抑郁癥相關(guān)的3條通路，使CREB磷酸化，關(guān)于大黃素甲醚對(duì)這3條通路的交匯點(diǎn)CREB有無作用還需做進(jìn)一步的研究。
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