NaF對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響探究論文
全身暴露于過(guò)量氟（F）可導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)和牙釉質(zhì)的發(fā)展受到干擾，過(guò)量氟引起的骨病變中，破骨性吸收占相當(dāng)重要的位置，雖然過(guò)度破骨性吸收是氟骨癥致殘的一個(gè)重要因素，但對(duì)破骨細(xì)胞的活動(dòng)研究很少。2012 年我們采用小鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞 RAW264.7構(gòu)建體外破骨細(xì)胞染氟模型，觀察破骨細(xì)胞染氟過(guò)程中的細(xì)胞增殖和分泌特異產(chǎn)物基質(zhì)金屬蛋白酶9（ma-trix metalloproteinase-9，MMP-9）和組織蛋白酶 K(ca-thepsin K)表達(dá)的影響。
1 材料與方法
1.1 破骨細(xì)胞前體細(xì)胞 RAW264.7 的培養(yǎng) 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW 264.7（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，用含10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM，Gibco，美國(guó)）培養(yǎng)液于 37℃、5% CO 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液一次，細(xì)胞增殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用0.25%胰蛋白酶室溫消化后計(jì)數(shù)備用。MMP-9和組織蛋白酶K純化多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森公司。
1.2 破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定 ①抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色：RAW264.7細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h 后用含終質(zhì)量濃度為 50 μg/L RANKL 和 50 μg/L小鼠重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子 （macrophage colonystimulating factor，M-CSF）的 DMEM 誘導(dǎo)分化劑。分別于誘導(dǎo)后第一、三、五和七天行TRAP染色。鏡下破骨細(xì)胞呈多核巨細(xì)胞，TRAP陽(yáng)性表現(xiàn)為酒紅色顆粒。②破骨細(xì)胞特異性基因檢測(cè)：用免疫組織化學(xué)的方法測(cè)定誘導(dǎo)后的染氟細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶9和組織蛋白酶K的表達(dá)，觀察并用Image-Pro Express圖像分析軟件鏡下掃描灰度。
1.3 接種細(xì)胞和分組小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞濃度 5×104個(gè)/ml接種24孔板，每孔加2 ml 培養(yǎng)基。按 NaF 濃度分組：對(duì)照組（NaF 濃度為0mg/L）占 6 孔/板；實(shí)驗(yàn)組每個(gè) NaF 濃度（2 mg/L、10mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L）占 6 孔/板。按時(shí)間分組：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組按時(shí)間分為24 h組、48 h組、72 h組，分別接種6塊板。
1.4 細(xì)胞活力測(cè)定 甲基偶氮唑藍(lán)（4，5-Dimethylthi-azol-2-yl-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法測(cè)定生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞懸液以5×104個(gè)/ml濃度接種于96 孔板。每組設(shè) 3 個(gè)平行孔，并設(shè)空白對(duì)照。貼壁培養(yǎng)24 h后分別加入不同處理因素，并測(cè)定不同作用時(shí)間（24、48、72 h）和不同濃度F的吸光度d值。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 Spss 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，方差齊的多組比較采用單因素變量多因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。
2 結(jié) 果
2.1 NaF 濃度對(duì) RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 空白組（NaF濃度為0 mg/L）與實(shí)驗(yàn)組（NaF濃度為2 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L）相比較，除NaF濃度為2 mg/L組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.276，P>0.05）外，其余各組平均值低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.74、7.32、11.87、15.93、24.38，均 P<0.05），表明 NaF 濃度對(duì) RAW264.7 細(xì)胞活力有抑制作用。在受試后的48 h，各實(shí)驗(yàn)組與空白組比較，僅60 mg/L（t=13.14)和80 mg/L（t=15.01）組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其余各組與對(duì)照組（0.43±0.002 t="0.46，P">0.05）。在受試后的72 h，與對(duì)照組（0.406 667±0.010 842）比較，僅80 mg/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.25，P<0.01），其余各組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.76，p>0.05），見(jiàn)表 1。
表1 實(shí)驗(yàn)組和空白組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力的比較(x ±s)
注：a. 與對(duì)照組比較，P<0.05；b. 與對(duì)照組比較，P<0.01。
2.2 NaF 濃度和作用時(shí)間對(duì) RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 0 mg/L時(shí)，48 h和72 h的細(xì)胞OD值均高于24h 的 OD 值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.21、6.03，P<0.05）；72 h 的細(xì)胞 OD 值低于 48 h 的 OD 值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.77，P<0.05）。在NaF濃度為2 mg/L時(shí)，48 h的 OD 值高于 72 h 的 OD 值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.91，P<0.05）；48 0="" 2="" 10="" 24="" 48="" 72="" h="" od="" l="" t="0.21，P">0.05）。當(dāng)NaF 濃度為 80 mg/L 時(shí)，3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.76，P>0.05）。
2.3 氟對(duì)體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的破骨細(xì)胞 MMP-9 和組織蛋白酶K蛋白質(zhì)表達(dá)的影響 氟對(duì)兩種蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)表2和表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在（10～40）mg/L 氟濃度作用 48 h 能使破骨細(xì)胞內(nèi) MMP-9 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.51，P<0.05）；在24 72h="" mmp-9="" t="1.09，P">0.05）。而氟對(duì)組織蛋白酶K的表達(dá)只在80 mg/L氟作用72 h時(shí)，能顯著降低在破骨細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
表2 氟對(duì)破骨細(xì)胞MMP-9蛋白質(zhì)表達(dá)的影響(x ±s)
注：a. 與對(duì)照組比較，P<0.05。
表3 氟對(duì)破骨細(xì)胞組織蛋白酶K蛋白質(zhì)表達(dá)的影響(x ±s)
注：a. 與對(duì)照組比較，P<0.05。
3 討 論
小鼠RAW264.7細(xì)胞作為一種單核巨噬細(xì)胞系，是體外研究破骨細(xì)胞分化的經(jīng)典細(xì)胞系，因?yàn)樵摷?xì)胞系可以在RANKL誘導(dǎo)的情況下穩(wěn)定分化為形態(tài)和功能均成熟的破骨細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)：①時(shí)間與NaF濃度交互作用對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響：NaF濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力有抑制作用，但并未使細(xì)胞死亡，而是細(xì)胞活性降低。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明NaF對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的抑制是暫時(shí)性的，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)NaF對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力 的 抑 制 作 用 在 減 弱 。 ② 本 實(shí) 驗(yàn) 未 見(jiàn) NaF 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力有促進(jìn)作用。NaF 只是暫時(shí)取代了RAW264.7細(xì)胞與活力有關(guān)的代謝因子，如果NaF濃度與此因子相當(dāng)，則代謝平衡不變；如NaF濃度為20 mg/L（濃度高或低），與此因子濃度不相當(dāng)，則暫時(shí)打破了這種平衡，但這種取代可能是可逆的'，隨時(shí)間延長(zhǎng)而恢復(fù)，即NaF對(duì)RAW264.7細(xì)胞的作用是有限的。這種因子可能與RAW264.7細(xì)胞的周期活動(dòng)相關(guān)的基因有關(guān)。龍麗、馬雷等研究發(fā)現(xiàn)，氟對(duì)破骨細(xì)胞的作用劑量過(guò)低（F含量遠(yuǎn)小于1 mg/L），所得結(jié)果與常識(shí)不符合，很可能與選擇兔細(xì)胞有關(guān)。本研究的結(jié)果與華坤、范哲和杜光等的研究基本一致，區(qū)別在本研究的劑量范圍較廣。氟對(duì)破骨細(xì)胞具有直接的作用，從細(xì)胞活力看，早期（24 h）以損傷作用為主，但在48 h顯示細(xì)胞從損傷狀態(tài)恢復(fù)。
MMP-9 主要在破骨細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞和一些骨基質(zhì)表面襯細(xì)胞中表達(dá)。MMP-9通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，在破骨細(xì)胞的遷移、侵蝕和錨著過(guò)程中發(fā)揮作用，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察氟對(duì)培養(yǎng)的大鼠破骨細(xì)胞MMP-9的影響，結(jié)果表明，隨染氟劑量的增加，MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，以10mg/L、20mg/L、40 mg/L 組最為明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.51，P<0.05）。說(shuō)明氟可通過(guò)提高M(jìn)MP-9的蛋白質(zhì)表達(dá)引起骨吸收活性的增加。
組織蛋白酶K（cathepsin K）屬于溶酶體半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族成員，1999年克隆成功，又稱(chēng)作 cathepsin O2，cathepsin X，cathepsin O。與其他組織蛋白酶不同，組織蛋白酶K具有分解骨組織中主要膠原（Ⅰ型膠原）的端肽區(qū)及螺旋狀結(jié)構(gòu)的能力發(fā)揮降解骨膠原的功能。而Ⅰ型膠原蛋白是含量最多的骨基質(zhì)蛋白，占整個(gè)基質(zhì)的90%，它在骨吸收過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在溶骨過(guò)程中參與骨基質(zhì)降解的酶主要有兩種—半胱氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），其中發(fā)揮主要作用的是半胱氨酸蛋白酶中的組織蛋白酶K，它選擇性地大量表達(dá)于破骨細(xì)胞，其生理作用底物正是在有機(jī)骨基質(zhì)中含量達(dá)95%的Ⅰ型膠原，除此之外還能降解骨基質(zhì)中的骨橋接素（osteopontin）和骨連接素（osteonectin），是破骨細(xì)胞中表達(dá)量最高、溶骨活性最強(qiáng)的的一種半胱氨酸蛋白酶，它對(duì)成骨膠原的降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他各種MMPs，是骨吸收過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。但本研究中各濃度的氟對(duì)破骨細(xì)胞的組織蛋白酶K表達(dá)影響較小，可能不是氟作用的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果尚需在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及人體實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證。
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