金黃色葡萄球菌β-溶血素的探究論文
金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，金葡菌)是一種自然界中廣泛存在的革蘭陽(yáng)性菌，可引起人和動(dòng)物的局部化膿性感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎以及敗血癥、膿毒敗血癥等，同時(shí)也是造成人類(lèi)食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一。金葡菌主要通過(guò)產(chǎn)生多種致病因子而致病，這些致病因子包括溶血素、殺白細(xì)胞素、腸毒素、凝固酶、耐熱核酸酶等。溶血素(hemolysins)，又稱(chēng)細(xì)胞溶素(cytolysin)，是由細(xì)菌分泌的能使細(xì)胞溶解的毒素，是金葡菌產(chǎn)生的一種重要毒力因子，包括α、β、γ、δ4種。其中α、γ、δ又稱(chēng)作打孔毒素(pore-formingtoxin)，即能跨細(xì)胞膜形成孔道，允許小分子和離子通過(guò)，從而使靶細(xì)胞代謝紊亂，最終裂解細(xì)胞。而β-溶血素作用機(jī)制與其他3種均不同，因此被稱(chēng)之為非打孔毒素。β-溶血素(β-hemolysins，Hlb)，全長(zhǎng)993bp，編碼330個(gè)氨基酸，1～34位氨基酸(aa)為其信號(hào)肽，相對(duì)分子質(zhì)量為35×103。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)Hlb的研究很少。已有研究表明，Hlb是一種鞘磷脂酶C，能特異性地水解鞘磷脂，Mg2+的存在能增強(qiáng)其生物活性。且Hlb在體外具有獨(dú)特的溶血活性:熱冷效應(yīng)(Hot-cold)溶血特性，即Hlb在37℃作用于紅細(xì)胞，紅細(xì)胞不易裂解，隨后置于4℃紅細(xì)胞則能夠迅速裂解。晶體結(jié)構(gòu)表明，Hlb的第149位和287位的組氨酸(H)是其發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵性位點(diǎn)，將149或287位的組氨酸(H)突變?yōu)樘於０?N)時(shí)，Hlb的鞘磷脂酶活性降低。此外，Medora等還發(fā)現(xiàn)Hlb具有結(jié)合核酸的活性。本研究以金葡菌NCTC-8325為模板擴(kuò)增得到Hlb的全長(zhǎng)序列，并構(gòu)建了野生型Hlb蛋白的重組表達(dá)載體，利用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了突變體HlbH-149-N蛋白的重組表達(dá)載體，獲得了Hlb及HlbH-149-N蛋白，驗(yàn)證其溶血活性，制備了Hlb的特異性抗體，并檢測(cè)抗體的中和活性。
1材料與方法
1.1材料
NCTC-8325菌株、原核表達(dá)載體pET-28a為本室保存;感受態(tài)DH5α及BL21(DE3)、HiFiTaq聚合酶、dNTP(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物技術(shù)公司)。原核表達(dá)載體pMD-19T、限制性內(nèi)切酶(NdeⅠ、XhoⅠ，TaKa-Ra公司);質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(賽百盛公司);T4DNA連接酶、DNA聚合酶、Trans2KplusDNA標(biāo)志物(北京全式金生物技術(shù)公司);低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(上海生化所);NiSepharose6FastFlow純化柱、CNBr-activatedSepharoseTM4B親和樹(shù)脂(GEHealthcare生物科學(xué)公司);綿羊血(芳元養(yǎng)殖場(chǎng));anti-His(鼠源)單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(中杉金橋公司);醫(yī)用X線膠片[銳珂(廈門(mén))醫(yī)療器材有限公司];SuperECL發(fā)光液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2方法
1.2.1Hlb重組蛋白的表達(dá)
1.2.1.1引物的設(shè)計(jì)和合成PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，正向引物:5'-CGCGGCAGCATATGGAATCTAAGAAAGATGAT-3';反向引物:5'-CACCACCACTCGAGCTATTTACTATAGGCTTTGA-3'，劃線部分為酶切位點(diǎn)。
1.2.1.2pET-28a-hlb重組質(zhì)粒的構(gòu)建以金葡菌菌株NCTC-8325基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下:94℃5min;94℃30s;60℃30s;72℃60s;30個(gè)循環(huán);72℃10min。擴(kuò)增片段大小為891bp。將PCR擴(kuò)增得到的hlb基因片段連接至pMD-19T，測(cè)序正確并利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，回收目的片段連入pET-28a載體，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆。
1.2.1.3Hlb蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化挑取陽(yáng)性克隆于LB(Kana+，50μg/ml)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接到新鮮的LB(Kana+，50μg/ml)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至D600約為0.4時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.05mmol/L和葡萄糖至終濃度為0.25%，繼續(xù)室溫培養(yǎng)6h，4℃8000r/min離心15min收集菌體。用超聲緩沖液(20mmol/LNa3PO4，0.5mol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH7.4)重懸菌體，超聲破碎菌體，4℃12000r/min離心5min，收集沉淀和上清，通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白在上清中的表達(dá)，接著將上清經(jīng)Ni2+親和柱進(jìn)行層析純化，先后通過(guò)含20mmol/L咪唑濃度的洗滌液洗滌Ni2+柱，最后用含500mmol/L咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白。
1.2.2Hlb蛋白溶血活性驗(yàn)證將購(gòu)買(mǎi)的新鮮羊血4℃1000×g離心10min，收集紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌綿羊紅細(xì)胞3次，每次4℃1000×g離心10min。取1ml綿羊紅細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(0.01mol/LNa3PO4，0.015mol/LNaCl，pH7.0，PBS)反復(fù)洗3次，每次2000r/min，10min去上清，以上述磷酸鹽緩沖液配制2%(V/V)的紅細(xì)胞懸液。利用上述磷酸鹽緩沖液配制1%PBSB溶液，隨后將Hlb蛋白稀釋至不同濃度。將2%綿羊紅細(xì)胞懸液與稀釋好的Hlb蛋白溶液等體積混合(200μl反應(yīng)體系)，37℃溫育1h后置于4℃1h，低速離心后取上清100μl，酶標(biāo)儀測(cè)定其在波長(zhǎng)405nm的光密度值。
1.2.3Hlb蛋白對(duì)不同物種紅細(xì)胞溶血活性測(cè)定將各物種(綿羊、小鼠、家兔、人)新鮮血液樣品配制2%的紅細(xì)胞懸液，以綿羊紅細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，將Hlb蛋白稀釋至不同濃度(0，0.5，1.0，2.0，4.0和8.0μg/ml)。將2%不同種屬紅細(xì)胞懸液與稀釋好的Hlb蛋白溶液等體積混合，37℃溫育1h后置于4℃1h。低速離心后取上清用酶標(biāo)儀測(cè)定其在波長(zhǎng)405nm的光密度值。
1.2.4多克隆抗體的制備以重組表達(dá)的Hlb蛋白為抗原免疫國(guó)產(chǎn)大耳白兔，首次免疫以弗氏完全佐劑乳化抗原，經(jīng)皮下注射接種Hlb蛋白1mg/只，2周后分別以弗氏不完全佐劑乳化抗原經(jīng)腹腔注射1次，第2次免疫后7d，經(jīng)耳緣靜脈采血，ELISA法測(cè)定血清中抗Hlb蛋白抗體效價(jià)。間隔3～4周后加強(qiáng)免疫2次，ELISA再次測(cè)定抗血清效價(jià)。最終采取心臟放血得到其抗血清。
1.2.5親和純化Hlb抗血清中anti-HlbIgG將Hlb蛋白偶聯(lián)至CNBr-activatedSepharoseTM4B樹(shù)脂制備親和柱，方法參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。將免疫后的兔血清過(guò)濾除菌后，與制備的Hlb親和樹(shù)脂孵育，20倍體積PBS洗滌后，用Gly-HCl(0.2mol/L，pH2.4)洗脫，并用Tris-HCl(1mol/L，pH9.1)中和至pH=7.4。
1.2.6多克隆抗體對(duì)Hlb蛋白溶血活性的抑制anti-Hlb(0.05μg)與不同濃度Hlb蛋白、2%的紅細(xì)胞懸液等體積混合，37℃溫育1h后4℃靜置1h。低速離心后取上清100μl，酶標(biāo)儀測(cè)定其在波長(zhǎng)405nm的光密度值。
1.2.7pET-28a-hlbH-149-N重組蛋白的表達(dá)
1.2.7.1突變體引物的設(shè)計(jì)與合成利用重疊PCR技術(shù)，將野生型hlb基因片段的第149位的組氨酸(CAT)突變?yōu)樘於０?GAT)，設(shè)計(jì)引物，正向引物Fm:5'-CGCGGCAGCATATGGATGTTTTCAAAAGC，反向引物Rm:5'-CACCACCACTCGAGATCCTGGATTTTTTC，劃線部分為酶切位點(diǎn)，全長(zhǎng)引物參見(jiàn)1.2.1.1。
1.2.7.2pET-28a-hlbH-149-N重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)重疊PCR法對(duì)hlb基因進(jìn)行點(diǎn)突變，首先以金葡菌NCTC-8325基因組為模板，利用全長(zhǎng)正向引物F和突變引物Rm進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR1)，同時(shí)以金葡菌NCTC-8325基因組為模板，用全長(zhǎng)反向引物R和突變引物Fm進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR2);純化上述PCR產(chǎn)物，等比例混合PCR1和PCR2純化產(chǎn)物使其為模板，加入全長(zhǎng)正反向引物F和R、dNTP、HifiTaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物即為引入了目的突變的全長(zhǎng)基因hlbH-149-N。
以上PCR循環(huán)條件均為94℃5min;94℃30s;60℃30s;72℃60s;共30個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR反應(yīng)總體積為25μl。酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定均參見(jiàn)Hlb蛋白的表達(dá)純化。
1.2.7.3HlbH-149-N
蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及純化參見(jiàn)1.2.1.3Hlb蛋白的表達(dá)純化。
1.2.8HlbH-149-N
蛋白溶血活性驗(yàn)證方法參見(jiàn)
1.2.2中Hlb蛋白溶血活性驗(yàn)證。
1.2.9Western印跡驗(yàn)證Hlb、HlbH-149-N蛋白的表達(dá)利用15%SDS-PAGE電泳分離重組的VraX蛋白，利用親和純化anti-Hlb抗體可特異性地檢測(cè)重組Hlb、HlbH-149-N蛋白的表達(dá)情況。
1.2.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，各組數(shù)據(jù)用珋x±s表示，利用SAS9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析和具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的兩因素設(shè)計(jì)定量資料的方差分析來(lái)處理數(shù)據(jù)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1Hlb重組蛋白的表達(dá)
2.1.1pET-28a-hlb表達(dá)載體的構(gòu)建以NCTC-8325基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得hlb基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為約891bp的單一條帶，與預(yù)期相符。繼而將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD-19T載體，菌落PCR鑒定結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物與pMD-19T連接成功。提取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，通過(guò)酶切獲得hlb片段并與pET-28a載體連接并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR結(jié)果顯示，hlb成功克隆至pET-28a載體。
2.1.2Hlb蛋白的表達(dá)和純化挑取pET-28a-hlb陽(yáng)性克隆，IPTG誘導(dǎo)后收集菌體并超聲處理。SDSPAGE電泳結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約37×103處檢測(cè)到了重組表達(dá)蛋白的條帶，與預(yù)期大小一致。目的蛋白主要存在于上清中，以可溶性表達(dá)為主。進(jìn)一步利用鎳離子螯合柱純化超聲上清，最終得到純度較高的目的蛋白。
2.1.3Hlb蛋白對(duì)綿羊紅細(xì)胞溶血活性測(cè)定利用PBSB溶液將Hlb蛋白稀釋至不同濃度，加等體積的2%綿羊紅細(xì)胞懸液，37℃孵育1h后4℃靜置1h。低速離心后取上清，測(cè)定其在波長(zhǎng)405nm的光密度值。結(jié)果顯示，Hlb能顯著裂解綿羊紅細(xì)胞，表明純化的Hlb具有很好的溶血活性。
2.1.4Hlb蛋白對(duì)不同物種紅細(xì)胞溶血活性測(cè)定將各物種(綿羊、小鼠、家兔、人)新鮮血液樣品配制2%的紅細(xì)胞懸液，以綿羊紅細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，將Hlb蛋白稀釋至不同濃度(0，0.5，1.0，2.0，4.0和8.0μg/ml)。將2%的不同種屬紅細(xì)胞懸液與稀釋好的Hlb蛋白溶液等體積混合，37℃溫育1h后置于4℃1h。低速離心后取上清用酶標(biāo)儀測(cè)定其在波長(zhǎng)405nm的光密度值。結(jié)果顯示，Hlb能顯著裂解綿羊紅細(xì)胞并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。對(duì)人和兔紅細(xì)胞的裂解能力低于綿羊紅細(xì)胞，而小鼠紅細(xì)胞對(duì)Hlb蛋白的溶血作用并不敏感。
相同濃度Hlb蛋白對(duì)不同種屬紅細(xì)胞的'裂解程度比較，采用具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的兩因素設(shè)計(jì)定量資料的方差分析，可知紅細(xì)胞類(lèi)型、Hlb濃度、紅細(xì)胞類(lèi)型與Hlb濃度的交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綿羊紅細(xì)胞分別與人、兔、小鼠紅細(xì)胞比較，在Hlb蛋白濃度為0時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，濃度分別為0.25、0.5、1、2、4μg/ml時(shí)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1.5Hlb特異多克隆抗體的制備及其中和活性測(cè)定利用重組Hlb蛋白免疫大耳白兔，經(jīng)過(guò)2次加強(qiáng)免疫，抗血清效價(jià)>1∶60000。親和純化免疫后的兔血清，ELISA結(jié)果表明，純化后抗體能夠與Hlb特異結(jié)合。進(jìn)一步在Hlb作用于綿羊紅細(xì)胞的同時(shí)，每孔加入0.05μganti-Hlb，即anti-Hlb與不同濃度Hlb、2%的紅細(xì)胞懸液等體積混合，37℃溫育1h后4℃靜置1h。低速離心后取上清，檢測(cè)405nm波長(zhǎng)的光密度值。結(jié)果顯示，anti-Hlb可有效抑制Hlb的溶血活性。以上結(jié)果表明，我們成功制備了具有良好中和活性的Hlb的特異性抗體。
2.2HlbH-149-N重組蛋白的表達(dá)
2.2.1pET-28a-hlbH-149-N表達(dá)載體的構(gòu)建同樣以NCTC-8325基因組DNA為模板，利用重疊PCR法擴(kuò)增hlbH-149-N基因，瓊脂糖凝膠電泳圖譜檢測(cè)顯示，擴(kuò)增得到的單一條帶與預(yù)期大小相符。菌落PCR鑒定結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物成功連接至pMD-19T載體，經(jīng)過(guò)與上述pET-28a-hlb相同的酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定過(guò)程，最終成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-hlbH-149-N。
2.2.2HlbH-149-N蛋白的表達(dá)和純化挑取pET-28a-hlbH-149-N陽(yáng)性克隆，IPTG誘導(dǎo)后收集菌體并超聲處理。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約37×103處檢測(cè)到了重組表達(dá)蛋白的條帶，與預(yù)期大小一致。目的蛋白主要存在于沉淀中，并以包涵體表達(dá)形式表達(dá)。經(jīng)變性復(fù)性后，進(jìn)一步利用鎳離子螯合柱純化，最終得到純度較高的目的蛋白。
2.2.3HlbH-149-N蛋白對(duì)綿羊紅細(xì)胞溶血活性測(cè)定以Hlb為陽(yáng)性對(duì)照，利用PBSB溶液將Hlb蛋白和突變體HlbH-149-N蛋白稀釋至不同濃度，加等體積2%的綿羊紅細(xì)胞懸液，37℃孵育1h后4℃靜置1h。低速離心后取上清，測(cè)定其在波長(zhǎng)405nm的光密度值。結(jié)果顯示，Hlb能顯著裂解綿羊紅細(xì)胞，而突變體HlbH-149-N不能裂解綿羊紅細(xì)胞，表明HlbH-149-N突變成功。
2.3Western印跡驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)利用15%SDS-PAGE電泳分離重組的Hlb蛋白，而利用親和純化的anti-Hlb抗體可特異性檢測(cè)Hlb、HlbH-149-N蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，成功表達(dá)了Hlb、HlbH-149-N蛋白，且目的蛋白與預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量(37×103)一致。
3討論
本研究成功構(gòu)建了pET-28a-hlb高效可溶性表達(dá)載體，獲得了純度較高的重組金葡菌Hlb蛋白，溶血活性檢測(cè)該蛋白能顯著裂解綿羊紅細(xì)胞。同時(shí)我們還檢測(cè)了Hlb蛋白對(duì)不同物種紅細(xì)胞的作用。結(jié)果表明，Hlb蛋白不同種屬紅細(xì)胞裂解作用不同，其中綿羊紅細(xì)胞作用敏感，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。Walev等認(rèn)為，這與細(xì)胞所含鞘磷脂的含量有關(guān)。同時(shí)我們利用點(diǎn)突變技術(shù)，獲得了不能裂解綿羊紅細(xì)胞的HlbH-149-N突變體蛋白。制備并純化了Hlb蛋白的特異性抗體，溶血活性檢測(cè)結(jié)果表明，Hlb蛋白的特異性抗體anti-Hlb能顯著抑制Hlb介導(dǎo)的紅細(xì)胞裂解作用，表明該抗體具有良好的中和活性。
目前對(duì)于金葡菌溶血素的研究大多集中在其毒性和致病機(jī)制上，但其具體作用機(jī)制尚不明確。國(guó)內(nèi)針對(duì)金葡菌溶血素的研究報(bào)道較少，溶血素作為一種外毒素并未得到應(yīng)有的重視。相對(duì)而言，國(guó)外對(duì)于溶血素的專(zhuān)門(mén)研究卻悄然興起，最近十幾年，溶血素的家族成員、分子結(jié)構(gòu)、分類(lèi)、作用機(jī)制日趨明朗。多種致病菌分泌的溶血素均為重要毒力因子。因此，抵抗細(xì)菌毒素對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷，不失為尋找代替抗生素治療細(xì)菌性疾病的一條新路。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了β-溶血素，并進(jìn)一步制備了具有中和活性的特異性抗體，為進(jìn)一步研究其致病的分子機(jī)制及其免疫保護(hù)作用提供了前期工作基礎(chǔ)。
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