細(xì)胞粘附肽RGD 的液相合成的探究論文
精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸( Arg-Gly-Asp，RGD) 三肽是細(xì)胞粘附蛋白的識(shí)別位點(diǎn)，含有RGD 序列的多肽許多都具有抗粘附性能，可抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜的粘附，加速腫瘤細(xì)胞脫附，阻止腫瘤細(xì)胞滯留，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。1984 年，Pierschbacher 等首次確定了RGD 序列為人纖維連接蛋白與其受體的結(jié)合位點(diǎn)。1985 年，Hayman 等將含RGD 序列的4 個(gè)寡肽與無(wú)RGD 序列的5 個(gè)寡肽進(jìn)行細(xì)胞粘附活性研究，發(fā)現(xiàn)含RGD 序列的肽有抑制正大鼠腎、變異的鼠腎、鼠BALB /C373、人骨肉瘤( MG63) 和人纖維素瘤( HT1080) 細(xì)胞的粘附作用，而無(wú)RGD 序列的5 個(gè)肽則沒(méi)有抗粘附活性。1987 年，Hynes報(bào)道，細(xì)胞表面存在與細(xì)胞粘附有關(guān)的ECM 糖蛋白受體，并將它們命名為整合蛋白。整合蛋白介導(dǎo)著許多種類的細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與底物之間的相互作用，參與許多生物學(xué)過(guò)程，例如，體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)、吞噬作用、細(xì)胞遷移、細(xì)胞信號(hào)傳遞、淋巴細(xì)胞的識(shí)別、血小板的聚集等。由于許多病理學(xué)過(guò)程與正常的細(xì)胞外基質(zhì)( ECM) 作用相關(guān)，含RGD 多肽或化合物有望用于某些疾病的治療。例如，將攜帶效應(yīng)分子的RGD 肽與整合素αvβ3特異性結(jié)合，可以提高治療效應(yīng)分子的靶向性。因此，該類肽的類似物成為藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)新的靶點(diǎn)。綜上所述，研究RGD 序列肽的合成具有重要意義。
在本文中，首先，采用一種新穎的化學(xué)法( 氨解取代法) 合成了二肽Gly-Asp，再利用N-羧基內(nèi)酸酐法合成了游離RGD 三肽，這種化學(xué)合成肽的方法與傳統(tǒng)上的化學(xué)法合成肽相比，具有高收率、低成本、合成量大的特點(diǎn)。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1. 1 主要儀器與試劑
RE52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 上海亞榮生儀器廠) ; DHG-9070A 電熱真空干燥箱( 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司) ; Nicolet370 紅外光譜儀( 美國(guó)Thermo 公司) ;LCMS-2010EV 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀( 日本島津公司) 。L-天冬氨酸( L-Asp) 、甘氨酸( Gly) 、Z-精氨酸( Z-Arg) ，購(gòu)自上海晶純化學(xué)公司; 乙酸乙酯、氯乙酰氯、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、無(wú)水硫酸鈉、四氫呋喃、三溴化磷、硼酸、四硼酸鉀、正辛醇、氫氧化鉀等均為市售國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
1. 2 實(shí)驗(yàn)方法
首先，將氯乙酰氯和L-Asp 在弱堿性條件下反應(yīng)，然后使用濃氨水取代氯，合成GD 二肽( Gly-Asp) ，再利用N-羧基內(nèi)酸酐法合成游離RGD 三肽。
1. 2. 1 L-Asp 的氯乙�；瘜�4. 8g L-Asp 與8mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%的氫氧化鈉溶液混合，并調(diào)pH 在11 ～ 12 之間，再加入8mL 乙酸乙酯，于冰浴下攪拌。以相同的速度滴加5mL 氯乙酰氯和27%的NaOH 到上述溶液中，保持pH 在11 ～ 12之間。滴速不能太快，滴完后繼續(xù)攪拌30min。結(jié)束反應(yīng)后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH = 1. 5，用乙酸乙酯萃取3 次，取上清液，合并萃取液，加無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜。減壓旋蒸除去乙酸乙酯，得到微黃色油狀物，靜置過(guò)夜。油狀物變?yōu)榘咨勰?/p>
1. 2. 2 氯乙酰化的L-Asp 氨解稱取所得的2. 0g 氯乙�；疞-Asp，加入12mL 濃氨水，冰浴下攪拌36h。減壓旋蒸上述反應(yīng)液，得到微黃色的油狀物。加乙醇振蕩，除去醇溶物，出現(xiàn)微黃色不溶物。加熱旋蒸，得淡黃色粉末。記為GD 二肽
1. 2. 3 NCA-Arg 的制備將5mL 四氫呋喃與3g ZArg在室溫下激烈攪拌至完全溶解，加入5mL 三溴化磷與20mL 四氫呋喃的混合溶液。室溫?cái)嚢?h后，反應(yīng)液未分層，旋蒸除去溶劑后，得到黃色焦油狀物，真空干燥過(guò)夜
1. 2. 4 N-羧基內(nèi)酸酐法合成RGD 三肽取1. 9g GD 二肽溶于pH = 10 的50mL 硼酸四硼酸鉀緩沖液體系( 0. 3g 硼酸+ 0. 1mol /L 50mL 四硼酸鉀1. 53g) 中。用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH 至10，加入1 滴辛醇，在激烈攪拌下一次加入一定量的NCAArg，并不斷加入氫氧化鉀保持pH = 10( 用pH 計(jì)監(jiān)測(cè)) ，約5min，加入濃硫酸調(diào)pH 至5 終止反應(yīng)。反應(yīng)液旋蒸除去水后，凍干。用少量水溶解后用乙醇沉淀，得到白的粉末狀固體。
1. 2. 5 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征將待測(cè)樣品溶于乙腈中，采用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，采用5μm 的150mm × 4. 6mm 色譜柱，流動(dòng)相為V乙腈∶ V水=80∶ 20，以1. 0mL /min 的.流速等度洗脫，上樣量20μL，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)λ = 220nm。
質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，流動(dòng)相為乙腈，流速為0. 3mL /min，上樣量5 μL。
紅外光譜檢測(cè)時(shí)，在瑪瑙研缽中，將待測(cè)樣品與KBr 按1 ∶ 150 比例混合，研磨均勻，壓成透明薄片。
2 結(jié)果與討論
2. 1 氯乙�；於彼岬慕Y(jié)構(gòu)表征
實(shí)驗(yàn)制得白色粉末狀氯乙�；於彼釣�6. 18g，產(chǎn)率約為82. 3%，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，其純度為95. 2%。氯乙�；於彼峤�(jīng)質(zhì)譜分析，正離子圖譜中的[M + Na]+ = 231. 9，與理論值231. 57( 氯乙�；於彼岬睦碚摲肿恿繛�208. 57) 吻合。
氯乙�；於彼岬募t外光譜圖見(jiàn)圖2。3211. 7cm - 1處的吸收峰歸屬為羧基中O—H 的伸縮振動(dòng)，2972. 4cm - 1 歸屬為飽和C—H 特征吸收峰，1692. 7cm - 1歸屬為羧基中C = O 的特征吸收峰，1564. 4cm - 1歸屬為酰胺鍵的特征吸收峰。
在反應(yīng)過(guò)程中，天冬氨酸的氨基在弱堿性條件下可以與氯乙�；噭┌l(fā)生反應(yīng)，生成氯乙�；於彼帷４朔磻�(yīng)需在冰浴下進(jìn)行，若溫度太高，副反應(yīng)多; 若pH 降低，也會(huì)有氯乙酸副產(chǎn)物生成。本實(shí)驗(yàn)選用水和有機(jī)相的混合溶劑，不僅可以減少水解副反應(yīng)的發(fā)生，還可使生成的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到有機(jī)相，促進(jìn)反應(yīng)發(fā)生。
2. 2 GD 二肽的結(jié)構(gòu)表征
實(shí)驗(yàn)制得淡黃色粉末狀GD 二肽為1. 55g，產(chǎn)率約為84. 8%。經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，其純度為98. 6%。GD 二肽的高效液相譜圖。
經(jīng)質(zhì)譜分析，GD 二肽的理論分子量是190. 07，[M + H]+ = 191. 07，所合成的樣品的正離子圖譜中的[M + H]+ = 191. 1 與理論值一致。GD 二肽紅外分析結(jié)果所示，在3450. 3 和3370. 4 cm - 1 出現(xiàn)的雙峰，歸屬為氨基的特征吸收峰，1690. 7cm - 1 的峰歸屬為羧基中C 匫的特征吸收峰，1619. 0cm - 1處是酰胺鍵的特征吸收峰。
在氯乙酰化天冬氨酸氨解生成二肽的過(guò)程中二肽可能與多余的氨水發(fā)生副反應(yīng)，太短反應(yīng)不完全，太長(zhǎng)副反應(yīng)多，所以反應(yīng)時(shí)間取為36h。反應(yīng)后要立即旋蒸除去氨氣。由于反應(yīng)放熱，低溫有利于產(chǎn)物產(chǎn)率的提高，所以也需在冰浴下反應(yīng)。
2. 3 RGD 三肽的結(jié)構(gòu)表征
實(shí)驗(yàn)制得白色粉末狀RGD 三肽為2. 47g，產(chǎn)率約為71. 4%。經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，其純度為94. 2%。
RGD 三肽的質(zhì)譜分析的正離子圖譜中的[M+ H]+ = 346. 1，與理論值[M + H]+ = 346. 3( RGD 三肽的理論分子量為345. 3) 吻合。RGD 三肽的紅外分析結(jié)果，其中，3420. 3cm - 1 的峰歸屬為氨基的特征吸收峰，1674. 9 和1619. 0 cm - 1 的峰分別歸屬為羧基中匔=O 和精氨酸中胍基 C=N 的特征吸收峰。
RGD 三肽合成中，應(yīng)該注意以下兩點(diǎn): 第一，在NCA-Arg 的制備中，控制催化劑溶液的溫度非常重要，一定要保持催化劑溶液溫度在0℃以下，因?yàn)槿寤? PBr3) 具有揮發(fā)性，溫度升高會(huì)使三溴化磷揮發(fā)，而失去催化活性; 第二，在RGD 三肽的合成中，需控制反應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。已經(jīng)知道，N-羧基在0℃下穩(wěn)定，在室溫下則易于分解放出CO2; 此外低溫有利于氨解反應(yīng)而不利于NCA 的水解和形成NCA 負(fù)離子。另外，需嚴(yán)格控制反應(yīng)在pH = 10 下進(jìn)行，pH 過(guò)低會(huì)使N-羧基脫羧而同NCA 反應(yīng)造成酸催化; 但pH 過(guò)高，不僅會(huì)使NCA 發(fā)生水解，而且還會(huì)導(dǎo)致通過(guò)形成NCA 負(fù)離子而發(fā)生的堿催化過(guò)頭或形成尿素衍生物。采用高速攪拌使反應(yīng)物能夠快速地均勻混合，因?yàn)樵诜磻?yīng)過(guò)程中，會(huì)有少量NCA 負(fù)離子存在，如攪拌速度較慢，會(huì)造成NCA 周圍的氨基酸濃度較小，從而導(dǎo)致NCA 同NCA 負(fù)離子反應(yīng)產(chǎn)生副產(chǎn)物。
3 結(jié)論
隨著RGD 肽類藥物的廣泛應(yīng)用和深入研究，有關(guān)RGD 肽類的合成越來(lái)越顯示其重要性和潛在的市場(chǎng)價(jià)值。本文使用液相合成法成功合成出RGD 三肽。首先以天冬氨酸為原料在pH = 11 ～12 之間、冰浴條件下進(jìn)行氯乙酰化，得到中間產(chǎn)物，然后在冰浴條件下與25% ～ 28% 氨水進(jìn)行氨解反應(yīng)，得到GD 二肽，最后利用NCA 法合成三肽。此方法具有高收率、低成本、合成規(guī)模大的特點(diǎn)。
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