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生物制藥專業(yè)畢業(yè)論文開題報告
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課題名稱 HPLC法測定伏立諾他有關(guān)物質(zhì)和含量的研究
[研究的主要目的和意義]
vorinostat (商品名Zolinza) 是Merck 公司開發(fā)的世界上第一個抑制組蛋白脫乙�；�( his2tone deacetylase ,HDAC) 的新型抗癌藥物,該藥于2015 年1月6 日獲得美國FDA 批準(zhǔn)上市,用于其他藥物治療時或治療后仍不能治愈、或惡化、或病情反復(fù)情況下的轉(zhuǎn)移性皮膚T 淋巴細(xì)胞瘤。vorinostat 化學(xué)名: N-羥基-N苯基辛二酰胺;英文名: N-hydroxy-N-phenyloctane-diamide
vorinostat 屬于組蛋白去乙�；敢种苿╊惪鼓[瘤藥物,低濃度( IC5《 86 nmol、L - 1) 即可以有效抑制組蛋白脫乙酰酶HDAC1 、HDAC2 、HDAC3 和HDAC6 的活性,抑制組蛋白次乙酰化,因而從基因水平調(diào)控細(xì)胞周期,阻斷癌細(xì)胞基因復(fù)制,并激活其凋亡基因,達(dá)到抑制和殺滅癌細(xì)胞的效果。但vorinostat 的抗癌機(jī)制仍在深入研究之中,其具體作用機(jī)制尚不完全清楚[6 - 7 ] 。兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)證明了vorinostat 的安全性和有效性,其中包括107 名接受其他藥物治療后又復(fù)發(fā)的CTCL 患者。按皮膚損傷改善標(biāo)準(zhǔn)評分等級的判斷,接受Zolinza 治療的患者中3%有所改善,療效平均持續(xù)168 d。
一些生物學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)證明了vorinostat 在皮膚癌，前列腺癌治療中的有效性。而且近年研究vorinostat 不僅可以單獨(dú)作為腫瘤治療藥物,還可以與其它抗癌藥物聯(lián)合用藥, 減少對正常細(xì)胞的毒性,具有增效作用�？膳c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(如52 雜氮22′2 脫氧胞苷、視黃酸、mRNA 轉(zhuǎn)錄抑制劑flavopiridol)[51- 53] 、凋亡受體配體(如阿霉素、長春新堿、依托泊苷、多烯紫杉醇)[54- 56]、化療藥物(如抗代謝藥吉西他賓、全反式維甲酸) [57,58]以及激酶抑制劑、放射線等聯(lián)合用藥。近年來研究發(fā)現(xiàn)vorinostat
還可影響到有絲分裂、DNA 復(fù)制和修復(fù)以及調(diào)控非組蛋白的蛋白質(zhì)乙�；潭取５窃撍幱糜谂R床治療癌癥仍然需要解決一些問題如: 抑制劑對HDAC 酶系的選擇識別作用、選擇最佳藥用劑量、治療周期以及尋找更多可以促進(jìn)這種藥抑制作用的物質(zhì)等。毋庸置疑,隨著對HDACIs 抗癌機(jī)理的深入研究,vorinostat 將會有廣闊的應(yīng)用前景。
伏諾立他目前在國內(nèi)還沒有上市，我們準(zhǔn)備仿制該品種，建立該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用建立的標(biāo)準(zhǔn)對原料和制劑進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)和主藥含量進(jìn)行研究。
[采用的研究手段及文獻(xiàn)綜述]
根據(jù)破壞試驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合伏立諾他合成工藝，建立伏立諾他有關(guān)物質(zhì)檢查方法，并對其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。
儀器與藥品
Waters 996光電二極管陣列檢測器，Waters Empower色譜工作站，試藥及其中間體均由南京海納醫(yī)藥科技公司提供
檢測波長的選擇
取伏立諾他適量,用流動相制成每1ml含15μg的溶液,照分光光度法(中國藥典2015年版二部附錄Ⅳ A)在200～40nm波長范圍內(nèi)掃描測定
系統(tǒng)使用性試驗(yàn)
色譜柱:Diamonsil C18 ( 25mm 4. 6 mm, 5μm)色譜柱為分析柱;乙腈- 0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)PH3.0)為流動相，不斷調(diào)節(jié)流動相比例，梯度洗脫，流速為1.ml 、min- 1 , 檢測波長為241nm, 柱溫30℃, 進(jìn)樣量: 20μl。
根據(jù)合成工藝,伏諾立他成藥中可能引入一系列的合成中間體及原料還有雜質(zhì)，取本品可能帶入的雜質(zhì)、中間體分別加流動相適量溶解;另取雜質(zhì)中間體及伏立諾他適量,用流動相制成適宜濃度的溶液,精密吸取雜質(zhì)，中間體與吡非尼酮混合溶液各2μl,分別進(jìn)樣，考察分離度，理論塔板數(shù)，及拖尾因子，再根據(jù)具體條件進(jìn)行調(diào)整，選出最適合的條件。
專屬性試驗(yàn)
取供試品,進(jìn)行高溫、光照、酸、堿、氧化破壞試驗(yàn)。
熱降解溶液的配制:取本品2mg,置25 ml量瓶中,置140℃高溫4 h后,用流動相溶解并稀釋至刻度; 光降解溶液的配制:取本品2mg,置25 ml量瓶中,用流動相制成每1 ml含吡非尼酮0. 8 mg的溶液,置紫外燈光下48 h;
酸降解溶液的配制:取本品2mg,置25 ml量瓶中,加2mol、L - 1鹽酸溶液5 ml,放置4 h,用2 mol、L - 1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性,加流動相稀釋定容;
堿降解溶液的配制:取本品2mg,置25 ml量瓶中,加2mol、L - 1氫氧化鈉溶液放置4 h,溶液顏色變黃,另加2 mol、L - 1鹽酸溶液調(diào)至中性,加流動相稀釋定容;
氧化破壞溶液的配制:取本品2mg,置25 ml量瓶中,加過氧化氫5 ml,避光放置4 h,用流動相稀釋定容。照高效液相色譜法,取上述各溶液各20μl進(jìn)樣,記錄結(jié)果，進(jìn)行分析 2.4線性范圍：
精密稱取伏立諾他對照品約15 mg,置50ml量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。分別精密量取貯備液1、2、3、4、5 ml置1ml量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻。分別取溶液20μl分別注入色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積,由溶液濃度(C) 對峰面積(A)線性回歸。
檢測限：取空白基線一段,計(jì)算其噪音峰高,再將伏立諾他樣品溶液用流動相稀釋適當(dāng)濃度進(jìn)樣,使其峰高為噪音峰高的3倍,記錄檢測限。
精密度試驗(yàn)
進(jìn)樣精密度：取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下高、中、低三種濃度的溶液,分別重復(fù)進(jìn)樣5 次,以峰面積來考察精密度。
中間精密度：選擇不同人員,分別測定同一批樣品的含量。
重復(fù)性試驗(yàn)：分別取同一批樣品, 6份,精密稱定,照樣品測定項(xiàng)下操作,計(jì)算含量。 2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)：照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法配制高、中、低三種濃度 的溶液,分別于0、1、2、4、6、8 h測定�？疾炱浞�(wěn)定性
含量測定：取本品適量,精密稱定,用流動相制成每1ml含50μg的溶液,作為供試品溶液,精密量取20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積;另取經(jīng)干燥至恒重的伏立諾他對照品適量,同法測定,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算,即得。
有關(guān)物質(zhì)測定：取本品適量,精密稱定,用流動相制成每1 ml含0.5mg的溶液,作為供試品溶液;精密量取供試品溶液1 ml,置10ml量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。精密量取對照溶液20μl,注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測靈敏度,使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10% ～25%;再精密量取供試品溶液和對照溶液各20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰,最大單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1 /2 ( 0.5% ) ,各雜質(zhì)峰面積總和,不得大于對照溶液主峰面積( 1% )。
參考文獻(xiàn)：
【1】黃小平，徐江. 組蛋白去乙�；敢种苿╊惪拱┧嶸orinostat[J].化工中間體，2015，06：11-13.
【2】Sakajiri S, Kumagai T, Kawamata N, et al. Histone deacetylase inhibitors profoundly decrease proliferation of human lymphoid cancer cell lines [J]. Exp Hematol, 2015,33(1): 53-61.
【3】Robert A.Parise, Julianne L.Holleran, Jan H.Beumera, Suresh Ramalingama, Merrill J. Egorin. A liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometric assay for quantitation of the histone deacetylase inhibitor, vorinostat
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